从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选获得一条阅读框为870 bp,编码289个氨基酸残基的基因,GenBank登陆号为:DN237560,在NCBI上对该序列进行同源性比对后初步确定其为家蚕中的一未知基因(假想基因),并命名为Bm-P312(Bombyxmori-P312)。将家蚕Bm-P312序列与家蚕基因组序列比对,结果表明该基因由一个外显子组成。从NCBI数据库中利用Blast检索,发现Bm-P312蛋白与已知蛋白没有同源性,与其他假想或者预测蛋白的同源性都低于30％,说明Bm-P312蛋白是一个结构和功能未知的蛋白。　　 我们根据开放阅读框设计上下游引物,PCR扩增目的基因,将扩增到的Bm-P312基因经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切插入到融合表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点,构建了重组融合蛋白表达质粒pET-28a(+)-Bm-P312,经PCR、酶切鉴定验证重组成功。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经终浓度1 mM的IPTG诱导工程菌表达后,SDS-PAGE分析表明在37 kD左右的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值37.1 kD(融合标签分子量3.8 kD,Bm-P312蛋白理论分子量33.27 kD)相符,重组蛋白主要存在于可溶的形式(菌上清)中。　　 通过镍柱亲和层析法纯化了重组蛋白,并使用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1:12800,Western blotting检测抗体特异性较好。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,结果显示,Bm-P312蛋白主要分布在细胞质中。　　 利用荧光定量PCR的方法,对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期,以及五龄幼虫各组织中Bm-P312的mRNA转录水平进行比较,分析发现在蛹期和生殖器、头部中转录水平较高。提取家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期及五龄幼虫各组织的总蛋白,进行免疫印迹实验,结果显示,Bm-P312蛋白在家蚕的蛹期以及生殖器、头部、丝腺中有较高量表达,转录和表达情况相对比较一致。　　 通过以上研究,我们证实Bm-P312基因在家蚕生殖器中转录水平和表达水平都是最高的,结合Bm-P312蛋白在家蚕卵巢表皮细胞Bm5中亚细胞定位的结果,我们推测该蛋白可能在家蚕的生殖发育过程中发挥一定作用。上述实验结果为将来对该蛋白功能和结构方面的进一步研究奠定了基础。