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膀胱癌是泌尿系统常见的肿瘤之一,每年全世界估计有430000新发病例和165100例死亡病例。75%的高危膀胱癌患者10年内会出现复发、进展或死亡,而高级别或肌层侵袭的膀胱癌患者5年生存率低于6%。膀胱癌可能是由于某些化学药剂,病原体或物理刺激引起的一系列基因改变所致。吸烟是膀胱癌的主要危险因素,吸烟者罹患疾病的风险高2-6倍。然而,膀胱癌的具体发病机制尚不清晰,并且在诊断、治疗及预后方面缺少理想的生物标志物。因此致病基因的筛选及作用机制研究对于膀胱癌的诊断和治疗具有重要意义。使用高通量测序技术进行膀胱癌全转录组学分析,有助于阐释膀胱癌的发生、发展机制。环状RNA具有保守性,表达丰度高,组织特异性等特征,有望成为某些疾病,特别是癌症理想的生物标志物。最近的研究表明circRNA参与了膀胱癌发病,进展和预后。因此,通过全转录组学分析、筛选circRNA,并进行检测和研究,将会有助于膀胱肿瘤的诊断和治疗。本研究分为以下三部分。第一部分膀胱癌全转录组测序分析目的:本研究使用5例膀胱癌患者的癌组织和癌旁组织进行全转录组学的高通量测序分析,鉴定新的转录本,并分析差异表达的转录本,筛选致病相关基因,为膀胱癌的诊断、治疗及预后判断寻找新的生物标志物。方法:收集膀胱全切或部分切除的膀胱癌组织标本,Trizol法提取RNA,琼脂糖电泳检测RNA完整性,构建测序文库并进行质检,使用HiseqⅩ测序,分析数据,构建基因表达谱,cuttdiff筛选差异基因,进行GO功能分析和KEGG通路富集,使用Pearson相关性绘制共表达网络,使用在线生物信息学软件CircInteractome、miRwalk和TargetScan分析测序结果,并绘制ceRNA网络。结果:纳入研究的标本RNA质控合格,测序结果共组装了118304个转录本,其中mRNA 68795个,lncRNA 38606个,circRNA 3376个,假基因6155个,其他组装结果1372个。筛选差异表达的基因进行GO功能富集,结果显示高表达的基因富集的功能主要是核小体聚集、有丝核分裂、细胞周期、细胞分裂、核小体和染色质DNA结合;低表达的基因富集的功能主要是间质迁移、蛋白磷酸化的负向调控和环磷酸腺苷蛋白激酶抑制剂活性。KEGG通路分析显示上调的基因富集的通路主要是谷胱甘肽代谢、DNA复制和细胞分裂;下调的基因富集的通路主要是钙离子通路、精氨酸及脯氨酸代谢和环磷酸鸟苷蛋白激酶通路。选择相关性大于0.99或小于-0.99的RNA绘制ncRNA-mRNA共表达网络,选择明显差异表达排序前20的ncRNA绘制ceRNA网络。结论:测序中发现新的转录本,可作为膀胱癌的诊断及预后的生物标记物;共表达分析及ceRNA网络有助于理解非编码RNA的功能;基因的功能富集分析有助于膀胱癌发病机制的研究,及寻找治疗靶点。第二部分hsacirc0018069在膀胱癌的表达检测及临床意义研究目的:差异表达的circRNA、lncRNA及mRNA有助于膀胱癌的诊断、治疗和预后判断,并可能在膀胱癌的发病及进展过程中发挥作用。我们从中筛选了7个差异表达的RNA,通过qRT-PCR检测上述RNA的表达水平,并分析其表达意义。方法:收集29例患者的膀胱癌及癌旁组织,Trizol法提取RNA,进行realtime-PCR验证,检测选择的7个RNA的表达水平。使用单因素方差分析对其中一个环状RNA hsacirc0018069进行临床相关性分析。使用Pearson相关系数筛选测序结果中与hsacirc0018069表达相关性高的mRNA,进行GO和KEGG分析;同时使用生物信息学在线软件预测可能调控的mRNA,绘制ceRNA网络,对调控网络中的mRNA进行GO和KEGG分析,判断hsacirc0018069在膀胱癌中可能发挥的功能。结果:7个RNA中circRNA-IGHG2未扩增,circRNA-PGM5、circ-KIAA1462、lncRNA IGFBP7-AS1在膀胱癌中表达下调,lncRNA GATA3-AS1、LINC00885、mRNA DAP表达上调,表达趋势与测序结果一致。hsacirc0018069在膀胱癌中明显低表达（P<0.01）,并且其低表达与肿瘤侵袭（P=0.046）密切相关,可作为膀胱癌早期诊断的生物学标记物（AUC:0.708,敏感性90%,特异性53%）。通过生物信息学分析,我们发现hsacirc0018069可能靶向结合miR-23c、miR-34a-5p、miR-181b-5p、miR-454-3p和miR-3666,可能通过粘附斑通路影响膀胱癌的侵袭。结论:筛选的RNA在膀胱癌组织中表达趋势与测序结果基本一致;hsacirc0018069在膀胱癌组织中表达下调,其低表达与T分期及肌层侵润相关,有助于膀胱癌的早期诊断;hsacirc0018069可能通过粘附斑通路发挥抑癌作用。第三部分hsacirc0006332在膀胱癌中作用机制的研究目的:我们发现hsacirc0006332同样是一个明显差异表达的环状RNA,我们推测其可能参与了膀胱癌的发病及进展。因此,我们通过成环特点分析,表达量检测,功能实验、裸鼠成瘤进一步研究其在膀胱癌中的作用机制。方法:使用Sanger测序、数据库比对、核酸外切酶消化实验分析hsacirc0006332成环特征;使用荧光原位杂交、核质分离实验对hsacirc0006332进行亚细胞定位;运用realtime-PCR检测hsacirc0006332在膀胱癌组织中的表达水平,使用单因素卡方检验进行临床相关性分析。选择T24和UM-UC-3细胞系,干扰hsacirc0006332的表达,进行CCK-8、EdU及克隆形成实验明确hsacirc0006332对膀胱癌细胞增殖的影响;使用Transwell检测hsacirc0006332对膀胱癌细胞侵袭的影响。双荧光素酶报告基因检测hsacirc0006332与预测的miRNA,miRNA与MYBL2的靶向结合位点及结合作用。裸鼠成瘤明确circ0006332对肿瘤生长的影响。结果:hsacirc0006332由MYBL2基因的第8和第9个外显子环化形成,长度为554nt,剪切点为GC,定位于膀胱癌细胞胞浆中,可耐受核酸外切酶消化。其在膀胱癌组织中高表达（P<0.001）,有助于膀胱癌早期诊断（AUC:0.86,敏感性81.3%,特异性80.2%）,与TNM分期（P=0.014）和肌层侵袭（P=0.029）相关。沉默circ0006332后膀胱癌的细胞活力、DNA合成期比例、克隆能力、侵袭能力受抑制。过表达circ0006332后膀胱癌的细胞DNA合成期比例、克隆能力和侵袭能力增强。circ0006332与MYBL2在组织及细胞系中表达呈正相关,并通过与miR-143及miR-1182结合影响MYBL2的表达进而影响膀胱癌细胞的增殖和侵袭改变。circ0006332影响裸鼠移植瘤的生长。结论:circ0006332是膀胱癌早期诊断中有价值的生物标志物;可通过吸附miR-143和miR-1182影响MYBL2的表达;circ0006332在膀胱癌的增殖、侵袭过程中发挥重要作用。