目的探讨培美曲塞与吉非替尼不同时序应用对人肺腺癌细胞PC-9和A549生长和凋亡的影响，从而获取最佳给药方式，并通过体外研究培美曲塞与吉非替尼按不同时序应用后对各组细胞周期及EGFR信号通路及TS酶蛋白的影响阐述其可能机制。方法1、体外培养人肺腺癌细胞PC-9、A549，MTT法检测不同浓度培美曲塞与吉非替尼单药作用PC-9、A549细胞24h、48h、72h的增殖抑制作用，并根据细胞增殖抑制率和药物浓度绘制量-效曲线，计算出培美曲塞和吉非替尼单药在PC-9、A549细胞中的半数抑制浓度（IC50）。2、固定浓度培美曲塞联合吉非替尼按不同时序作用于PC-9、A549细胞后，MTT法检测两药不同时序应用对肺腺癌细胞的增殖抑制作用，比较各组细胞增殖抑制情况。3、流式细胞仪检测培美曲塞和吉非替尼不同时序应用后各组细胞凋亡及细胞周期分布情况。4、Western印迹法检测培美曲塞和吉非替尼不同时序应用对EGFR下游信号通路蛋白[磷酸化表皮生长因子受体(phosphoryed EGFR, p-EGFR)、磷酸化胞外信号调节酶（phosphorylated ERK, p-ERK）和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated AKT,p-AKT)及胸苷酸合成酶（thymidylate synthetase, TS）在蛋白水平表达的影响。结果1、吉非替尼和培美曲塞单药作用肺腺癌细胞PC-9、A549均能抑制细胞生长，呈时间和浓度依赖性。吉非替尼作用于A549细胞(野生型)72h的IC50为8.937±0.356μmol/L，作用于PC-9细胞(突变型)72h的IC50为0.049±0.004μmol/L，吉非替尼在A549细胞中作用72h的IC50约为PC-9细胞中的近200倍。培美曲塞作用于PC-9细胞72h的IC50为0.483±0.040μmol/L,作用于A549细胞72h的IC50为2.742±0.505μmol/L。2、以固定浓度培美曲塞联合吉非替尼，各浓度组中培美曲塞序贯吉非替尼、培美曲塞同步联合吉非替尼对PC-9、A549细胞作用的增殖抑制率和凋亡率均较单药组明显提高（P<0.05），且培美曲塞序贯吉非替尼作用两种细胞的增殖抑制率和凋亡率较培美曲塞同步联合吉非替尼效应更加显著（P<0.05），而吉非替尼序贯培美曲塞较单药组抑制率和凋亡率均无显著差异。3、培美曲塞提高EGFR、AKT、ERK磷酸化水平，而吉非替尼表现为抑制作用，同时吉非替尼降低TS酶表达。培美曲赛序贯吉非替尼、培美曲赛同步联合吉非替尼作用后，较单药组均进一步抑制EGFR、AKT、ERK磷酸化水平。4、吉非替尼主要将PC-9、A549细胞阻滞在G0/G1期，培美曲塞主要将细胞阻滞在S期，培美曲塞同步联合吉非替尼、培美曲塞序贯吉非替尼较其他组G2/M期细胞比例提高（P<0.05）。结论培美曲赛序贯吉非替尼、培美曲赛同步联合吉非替尼在PC-9、A549细胞中均起到协同增效作用，且培美曲赛序贯吉非替尼协同作用更加显著。