动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种由多种因素引起的慢性炎症性疾病，主要以内皮功能紊乱、内膜下脂质沉积、平滑肌细胞迁移和增殖以及泡沫细胞的形成为特征。它是引起脑梗塞、心肌梗塞以及冠心病等心脑血管疾病的重要病理基础，AS及其并发症的发病率、死亡率非常高，严重威胁着人类健康。迄今为止提出了多种病因学说，如脂肪浸润学说、血栓形成和血小板聚集学说、损伤反应学说和克隆学说等都不能对AS的确切发病机制提供比较满意的解释，因此对其仍缺乏有效的预防和控制措施。DNA甲基化是一种表观遗传(epigenetic)修饰，在DNA甲基转移酶催化下，利用S一腺苷甲硫氨酸提供的甲基，将胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，从而使胞嘧啶转化为5.甲基胞嘧啶，调控基因表达。在人和兔的粥样斑块病变血管中发现基因组DNA呈广泛的低甲基化，整体基因组5-MC百分含量明显减少。对apoE基因缺陷的小鼠研究表明，在小鼠尚未出现任何组织学上可以检测的血管病变时，DNA甲基化的异常在主动脉和外周血单核细胞中已经出现。在高同型半胱氨酸血症(hyperhomoeysteinemia，HHcy)和衰老等AS的独立危险因素致AS发生过程中，均发现有DNA甲基化的异常改变，因此甲基化模式异常可能是与多种疾病的发生相关，特别是参与年龄相关慢性疾病(包括As和肿瘤)形成过程。甜菜碱有3个活性甲基，是高效的甲基供体，主要在肝脏中发挥甲基供体的作用，能够降低血浆同型半胱氨酸浓度，防治脂肪肝，改善血脂等，甜菜碱还可以通过增强机体的抗氧化能力，从而减少肝脏的氧化损伤。机体抗氧化酶系统中，超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是唯一将超氧阴离子催化成相对稳定的过氧化氢的抗氧化酶家族，在抗氧化应激导致的多种疾病包括动脉粥样硬化发生的过程中发挥了重要的作用。哺乳动物体内SOD以铜锌超氧化物歧化酶(CuZn superoxidedismutase，SOD1)为主，其含量最高。有实验发现，AS的发生发展过程中SOD基因甲基化有异常改变。为了进一步了解甜菜碱对AS发生发展的作用，以及在此过程中对DNA甲基化模式可能的影响，探讨其可能的作用机。本研究对apoE基因缺陷小鼠以不同剂量甜菜碱进行干预，通过测定抗氧化因子CuZnSOD的表达、甲基化模式的可能改变及主动脉斑块面积来探讨甜菜碱对apoE基因缺陷小鼠AS发生发展的影响及甜菜碱抗AS可能的作用机制，为心血管疾病的预防和治疗提供新资源和思路。 研究目的：本实验通对apoE基因缺陷小鼠以不同剂量的甜菜碱进行干预，研究甜菜碱在AS发生和发展过程中所起的作用，并从CuZnSOD基因启动子区CpG岛甲基化状态及其表达探讨甜菜碱作用的可能机制。 研究方法： 1.实验动物及分组 本次实验以54只7周龄apoE基因缺陷小鼠(品系C57BL/6J)和18只7周龄C57BL/6J小鼠作为研究对象，按体重随机区组法分为五个组：阴性对照组(C57BL/6J小鼠)、阳性对照组、1％甜菜碱组、2％甜菜碱组和4％甜菜碱组。阴性和阳性对照组饲以AIN-93饲料，1％、2％、4％甜菜碱组分别饲以添加1％、2％、4％甜菜碱的AIN-93饲料。所有实验小鼠放在层流架中分笼饲养，每笼4只，自由摄食饮水，每周称体重，并记录进食量。0周时分别从apoE基因缺陷小鼠和正常小鼠中随机抽取6只，饲养至第7周时每组随机抽取6只，其余小鼠饲养至14周，所有小鼠做如下处理： 1.1经摘除眼球采血后处死小鼠，采集小鼠血液待凝固后离心分离血清，保存于-40℃。 1.2分离心脏、肝脏、脾脏和肾脏用于脏器系数评价，并将肝脏冻存于-80℃。 1.3将心脏、肝脏用10％的福尔马林液固定。 1.4分离主动脉，-80℃冻存。 2.检测指标及方法 2.1小鼠主动脉窦脂质斑块面积：冰冻切片，油红O染色法。 2.2小鼠肝脏CuZnSOD基因甲基化的状态：甲基化特异性聚合酶链反应法(Methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)。 2.3小鼠肝脏CuZnSOD基因mRNA的表达：荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)。 2.4小鼠肝脏CuZnSOD蛋白表达的测定：免疫组织化学法。 实验结果： 1.不同实验组小鼠的一般状况不同实验组小鼠日平均进食量差异无统计学意义，约为2.6g/d。各组间主要脏器(心，肝，脾，肾等)脏体比值(脏器重量(g)/体重(100g))，差异没有统计学意义(P>0.05)。体重增长阴性对照组小鼠最快，然后依次为阳性对照组，1％，2％，4％甜菜碱组，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。 2.补充甜菜碱对各组小鼠主动脉窦脂质斑块面积的影响饲养至14w，2％和4％甜菜碱组小鼠主动脉窦脂质斑块面积少于阳性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。 3.不同实验组小鼠CuZnSOD基因启动子甲基化状态各实验组小鼠CuZnSOD基因启动子CpG岛甲基化状态的差异没有统计学意义(P>0.05)。 4.不同实验组小鼠肝脏CuZnSOD基因mRNA的表达不同时间阴性对照组mRNA表达均高于阳性对照组。7周时，1％甜菜碱组肝脏CuZnSOD基因mRNA表达高于2％甜菜碱组、4％甜菜碱组，差异有统计学意义(P<0.05)；14周时，1％甜菜碱组肝脏CuZnSOD基因mRNA的表达高于阳性对照组、2％甜菜碱组，差异有统计学意义(P<0.05)；合并7周与14周数据进行方差分析，阴性对照组mRNA表达高于阳性对照组，1％甜菜碱组mRNA表达高于阳性对照组、2％甜菜碱组，差异有统计学意义(P<0.05)。 5.不同实验组小鼠CuZnSOD蛋白表达阴性对照组蛋白表达均高于阳性对照组、1％甜菜碱组、2％甜菜碱组、4％甜菜碱组，差异有统计学意义(P<0.05)。阳性对照组、1％甜菜碱组、2％甜菜碱组、4％甜菜碱组蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论： 1.甜菜碱能够降低apoE基因缺陷小鼠的体重，呈现明显的剂量效应关系。 2.甜菜碱能够改善apoE基因缺陷小鼠的脂质沉积，减少主动脉窦粥样斑块面积。 3.对肝脏中CuZnSOD基因CpG岛甲基化进行检测，apoE基因缺陷小鼠在AS发生过程中并未表现出和正常小鼠甲基化状态的不同，甜菜碱干预没有改变其基因的甲基化模式，提示在CuZnSOD基因可能没有参与．AS发生发展过程中DNA甲基化的异常改变。 4.apoE基因缺陷小鼠体内肝脏CuZnSODmRNA与蛋白的表达低于正常小鼠，补充甜菜碱可以增加肝脏CuZnSOD mRNA的表达。