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目的：噬菌体M13mp2特殊的生活史决定了每一种噬菌体有双链和单链两种DNA形式，以其为材料构建含有单碱基错配的异源双链DNA分子，用于检测由hMSH2-hMSH6(hMutSα)识别错配启动的修复过程；以及含有双碱基缺失的异源双链DNA分子，用于检测主要由hMSH2-hMSH3(hMutSβ)识别插入-缺失环(insertion-deletion loop，IDL)启动的修复过程。以这两种分子作为待修复模板；以TK6细胞株作为错配修复功能完整表型，以Lovo细胞株作为错配修复功能缺陷表型，构建体外错配修复(mismatch repair，MMR)功能检测模型。并使用诊断明确的遗传性非腺瘤病性结直肠癌(herediary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)及散发性大肠癌(sporadic colorectal cancer，SRC)评价该模型的检测准确性和敏感性。模型稳定后，将其应用于弥漫性大B细胞性淋巴瘤(diffuse large B celllymphoma，DLBCL)，与其他的检测手段一起共同探讨MMR系统与DLBCL发病机制的相互关系。 方法：，首先用限制性酶将噬菌体环状双链dsDNA切割成线性双链，通过变性得到线性单链DNA(负链)与其他不同类型的环状单链DNA(正链)杂交退火，这两条单链除了预设的一个或两个突变位点以外，其余部位都是互补的，形成一个带缺刻(nick)的环状异源双链DNA分子。将这个含有错配碱基的异源双链DNA分子转化本身错配修复功能缺陷的宿主菌E．coli(NR9162)。通过在铺有x-gal和IPTG的培养平板上出现的噬斑形态，了解异源双链DNA分子构建的结果。 随后，提取TK6淋巴母细胞淋巴瘤细胞株和而结肠癌细胞株Lovo的全细胞蛋白，经过大T抗原依赖性SV-40 DNA复制检测证实其生物学功能保持完整后，与上述两种异源双链DNA分子共同孵育。根据孵育前后噬斑变化计算出修复效率，了解其错配修复系统的功能状态与既往已知的TK6具有完善的错配修复功能；而Lovo由于其hMSH2基因外显子3～8发生纯合性缺失MMR功能缺陷的遗传学特征的吻合情况。建立起体外错配修复功能检测模型。提取1例诊断明确的HNPCC及1例散发性大肠癌病人的肿瘤组织总蛋白，与上述异源双链DNA复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文中文摘要作用;并应用国际1廿护CC小组推荐的5个微卫星位点对这两个病例进行检测，从而检验该模型的敏感性和准确性;并对临床工作中的技术应用提出意见。 应用该模型对选择的25例弥漫性大B细胞性淋巴瘤病例进行检测，首先提取液氮冻存新鲜组织的DNA进行7个由单核昔酸重复序列组成的微卫星位点稳定性的测定;同时对相应病例的石蜡保存标本进行PCNA的免疫组织化学检测;然后对新鲜样本中提取的肿瘤组织总蛋白进行大T抗原依赖性SV-40 DNA复制检测;只使用被证明生物学活性保持良好的样本进行体外错配修复功能分析。 结果:构建的含有单碱基错配G.G和双碱基缺失del(2)的异源双链DNA分子花铺有x一gal和IPTG的指示平板上都出现了代表重组克隆的混合噬斑，从而证明异源双链DNA构建成功。使用错配修复功能完善的细胞株TK6及错配修复功能缺陷的细胞株Lovo的全细胞蛋白提取物与之作用，证实TK6对双碱基缺失del(2)的修复效率超过60%，对单碱基错配G.G的修复效率超过50%;而Lovo对双碱基缺失del(2)的修复效率低于20%，对单碱基错配G.G的修复效率低于10o’乞。与相关文献报道数据相似。以异源双链DNA为待修复模板，以TK6和Lo，o为错配修复功能完整和缺陷的表型，建立体外错配修复功能检测模型。应用该模型检测1例H刊PCC和1例散发性大肠癌的肿瘤组织全蛋白提取物后发现HNPCC病人肿瘤组织修复效率与TK6相比差异有显著性，与Lovo相比差异无显著性，说明其MMR功能缺陷;1例散发性直肠癌组织其错配修复效率与TK6相比差异无显著性，与Lovo相比差异有显著性，说明其仍然具有M队IR功能。与这两种大肠癌不同的发病机制相一致。同时，对这两例标本进行微卫星检测发现HNPCC病人在检测的5个位点中均不稳定，表现为高度微卫星不稳(microsatelliteinstabilitv，high Msl一H);而sRc病人5个位点均未见不稳，表现为微卫星稳定Mss(micr。Satel一ite Stabilit又Mss)。对25例DLBCL的检测中发现所有病例在检测的7个微卫星位点中均没有发现MSI;而参与M入」卫.全过程的PCNA在全部病例中高表达;经大T抗原依赖性SV-40 DNA复制证实生物学活性保持良好的10个DLBCL进行体外错配修复功能分析后发现，所有病例对单碱基错配的修复功能均保持完整;但是有3个病例对双碱基缺失的修复功能降低与TK6相比差异有显著性。 结论:以含有单碱基错配和双碱基缺失的异源双链DNA分子为待修复模板，以细胞株TK6为错配修复功能完整表型，以细胞株Lov。为错配修复功能缺陷表型，在国内首次建立体外错配修复功能检测模型。应用该模型检测诊断明确的HNPCC和SRC病人肿瘤组织的M入4R功能状态，其结果与各自不同的发病机制及微卫星状态一致，说明该模型具有的检测准确性和敏感性。同时也说明，国际I诬NPCC合作小组推荐的5个微卫星位点具有较高的检测敏感性，是临床工作中复旦大学攻读博士学位研究生毕业论文中文摘要首选的检测手段;而对于家族史不明确，或微卫星稳定，而诊断存在?