研究背景卵巢癌是常见妇科恶性肿瘤之一,由于发病隐匿、肿瘤异质性以及高转移率等,大多数患者就诊时己处于晚期,从而使其死亡率高居女性生殖道恶性肿瘤之首。随着手术和化疗的发展,卵巢癌的治疗虽然取得了一定的疗效,但在疾病发展过程中,仍有大约三分之二的卵巢癌患者会出现恶性腹腔积液。恶性腹水可严重影响患者的生活质量,并引起一系列腹水相关症状包括腹胀、腹痛、呼吸困难、恶心、呕吐、食欲不振、乏力等,同时也是降低患者总生存时间的独立危险因素。尽管治疗卵巢癌恶性腹水的方法有许多,包括原发肿瘤的治疗、腹腔穿刺引流、利尿、低盐饮食等,但大部分方法的疗效有限,同时患者对上述方法的耐受程度也是有限的。由于目前尚无针对卵巢癌恶性腹水规范的治疗指南,腹水一旦复发或者耐药,其治疗将变得异常棘手和极具挑战性。因此,迫切需要寻找一种新兴而有效持久治疗卵巢癌恶性腹水的治疗手段。近年来,随着对肿瘤发生发展机制的深入研究以及生物技术的迅速发展,生物治疗已成为继传统的手术、化疗、放疗等传统疗法之外的第四种有效的抗肿瘤治疗方法。肿瘤的生物治疗是通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然产生的靶向性很强的物质来取得抗瘤效应的新疗法,其中过继性细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式。过继性细胞免疫治疗是运用生物技术和生物制剂对患者体内采集的免疫细胞如细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、树突状细胞(DC)、NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte, TILs)等进行体外培养和大量扩增后再回输至患者体内,从而激发及增强机体自身免疫功能来达到治疗肿瘤的方法。其中过继性TILs免疫治疗策略是目前最具有发展潜力的细胞疗法。TILs是存在于肿瘤间质内的具有抗原特异性的以淋巴细胞为主的致敏淋巴细胞群体。TILs经体外生物制剂如重组人白介素-2(rInterleukin-2, rIL-2)刺激活化后,其生长扩增能力和杀瘤活性均明显增强,为淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)的50-100倍。继Rosenberg首次报道过继性TILs细胞可有效治疗恶性黑色素瘤之后,国内外也开始陆续开展TILs细胞治疗卵巢癌的临床研究。Aoki等第一次将IL-2活化扩增后的TILs用于晚期或复发上皮性卵巢的治疗。令人欣慰的发现单独TILs治疗组(7例)中有5例获得缓解,TILs联合化疗组(10例)中有9例获得缓解。Freedman等在1994年纳入11例卵巢癌患者行腹腔注射TILs联合r1L-2治疗,不幸地是,无一例患者获得临床缓解。然而,我院张军一等采用IL-2/TILs治疗187例恶性胸腹腔积液患者取得了较好的疗效,胸腔积液总有效率为87%,腹腔积液总有效率为58.82%,胸腹腔积液中瘤细胞转阴率达66.67%,瘤细胞退变或减少率达16.67%。尽管TILs治疗卵巢癌的临床研究甚少,且结果喜忧参半,但TILs细胞能有效治疗卵巢癌的理论依据却非常充足。首先,卵巢癌细胞表达大量可作为免疫反应靶点的肿瘤相关抗原。其次,大量研究已证实肿瘤组织内TILs细胞的含量,尤其是CD8+T淋巴细胞,与卵巢癌患者预后呈显著正相关。最后,具有免疫原性的卵巢癌可表达大量能被T淋巴细胞识别的信号肽/MHC复合物。然而,目前制约TILs细胞治疗卵巢癌临床研究进展及治疗疗效的主要因素涉及TILs细胞制备技术方法不统一、TILs细胞培养时间太长、TILs细胞各成分抗瘤机制不明确、TILs细胞回输数量及质量的最佳性、无合理选择患者的统一标准、联合治疗应用的最佳选择等。但考虑到TILs治疗卵巢癌的潜在有效性,通过改善分离培养TILs细胞的实验方法,并深入了解TILs细胞的抗瘤活性及机制可能是提高TILs治疗卵巢癌临床疗效的有效方法之一。因此继续深入研究TILs细胞的制备方法、生物学特性、抗瘤活性以及治疗卵巢癌的有效性仍然是今后的研究方向。目前TILs治疗卵巢癌的临床和基础研究均很少,且大多数临床研究仅限于小样本非随机的I期临床试验。虽然我院前期临床观察研究已发现腹腔回输TILs联合rIL-2可有效治疗肿瘤患者的恶性胸腹水,但并没有进一步研究TILs的抗瘤机制,以及分析比较TILs联合或不联合化疗治疗卵巢癌的有效性。因此为了寻找卵巢癌恶性腹水新的治疗模式,本研究拟回顾性分析我院腹腔回输TILs联合或不联合化疗治疗32例卵巢癌恶性腹水患者的临床疗效和毒副作用。同时,通过建立一套从卵巢癌实体瘤组织或腹水中同时高效分离TILs和自体卵巢癌细胞的技术方法,以进一步研究TILs对卵巢癌细胞的体外抗瘤活性机制,从而为今后TILs在卵巢癌中的进一步研究和应用提供更多的依据。目的(1)回顾性分析腹腔回输TILs联合或不联合化疗治疗卵巢癌恶性腹水的临床疗效和毒副作用,以期寻找治疗卵巢癌恶性腹水的最佳治疗方法。(2)成功建立一套从卵巢癌组织或腹水中同时高效分离TILs和原代卵巢癌细胞的成熟技术路线。(3)研究TILs经体外rIL-2活化扩增前后CD3+、CD8+/CD3+和CD4+/CD3+ TILs细胞亚群比例的变化。(4)研究TILs活化扩增前后对肿瘤细胞特异性和非特异性杀伤活性的变化。(5)研究rIL-2活化扩增后的TILs细胞对自体卵巢癌细胞肿瘤标志物及腹水形成因子分泌的影响。(6)研究rIL-2活化扩增后的TILs细胞对自体卵巢癌细胞凋亡率及凋亡蛋白的影响,以期进一步探讨TILs抗肿瘤的生物学机制。研究内容及方法1.临床部分(1)回顾性收集2001年1月至2011年12月我院32例卵巢癌并发恶性腹水患者的临床病理资料。(2)32例卵巢癌恶性腹水患者中,有8例单纯接受腹腔回输TILs治疗(TILs组),13例单纯接受静脉化疗治疗(化疗组),11例接受静脉化疗联合腹腔回输TILs治疗(联合治疗组)(3)收集所有患者治疗前后的病史资料、体能评分(KPS)、腹水相关症状(精神萎靡、食欲不振、失眠、呼吸困难、恶心、呕吐、腹痛、腹胀、乏力)、血常规指标、CA125和白蛋白指标。(4)统计分析不同治疗方法对卵巢癌恶性腹水患者生活质量的影响,即分析治疗前后腹水相关症状和KPS的改善情况。(5)比较分析不同治疗方法对卵巢癌患者腹水及实体瘤控制率的差异。(6)比较分析三种治疗方法对卵巢癌恶性腹水患者生存预后的影响。2.实验部分(1)无菌收取2014年1月至2014年12月南方医科大学南方医院14例初诊卵巢癌患者的实体瘤组织或腹水。(2)采用联合酶消化法、贴壁法、Ficoll不连续密度梯度离心法等方法分离获得TILs和自体卵巢癌细胞。(3)流式细胞仪检测TILs经rIL-2活化扩增前后CD3+、CD8+/CD3+和CD4+/CD3+TILs细胞亚群比例的变化。(4)MTT法检测TILs活化扩增前后对肿瘤细胞的特异性和非特异性杀伤活性变化。(5)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测自体卵巢癌细胞经活化扩增TILs处理前后其分子标志物CA125及腹水形成因子MMP-9、VEGF水平的变化。(6)凋亡试剂盒检测活化扩增后的TILs诱导自体卵巢癌细胞发生凋亡的情况。(7)免疫组化法检测活化扩增后的TILs对自体卵巢细胞中凋亡相关蛋白Caspase3表达的影响。研究结果1.临床结果(1)卵巢癌恶性腹水患者的临床特征32例卵巢癌恶性腹水患者的中位年龄为56岁。所有患者中浆液性腺癌21例,FIGO分期Ⅱ期1例,Ⅲ-IV期共有31例。腹水细胞学阳性27例,阴性5例。三组患者之间的年龄、临床分期、减瘤满意度、病理类型、组织学分级、腹水细胞学涂片和腹水深度之间均无统计学差异(P>0.05)。(2)腹腔回输TILs细胞的基本特征TILs治疗组中,TILs的平均培养时间为10.3±2.8天,腹腔注射TILs的总数量范围为9×109到39×109个(24.3±±11.4 x109)。联合治疗组中,TILs的平均培养时间为10.5±3.6天,腹腔注射TILs的总数量范围为3×109到54×109个(25.2±17.0×109)。TILs培养时间和TILs回输剂量在两组患者之间无统计学差异。(3)不同治疗方法对卵巢癌患者生活质量的影响与治疗前相比,32例患者的生活质量在治疗后均得到了明显的改善,KPS评分(均数±标准差)由62.2±10.4升高至74.4±13.7,腹水相关症状评分由1.4±0.6降至0.6±0.7,差异均有统计学意义(P<0.001)。TILs组卵巢癌患者的KPS、腹水相关症状和白蛋白在治疗前后均无明显差异。化疗组患者中仅KPS、腹胀、厌食和乏力症状得到了显著地改善。联合治疗组中,除呼吸困难、恶心和呕吐症状无显著改善以外,余腹水相关症状、KPS和白蛋白均获得了显著地改善(P<0.05)。(4)不同治疗方法的疗效评价联合治疗组患者的腹水客观缓解率为90.9%,显著高于TILs组(37.5%,P=0.009)和化疗组(53.8%,P=0.047)。同时联合治疗组的肿瘤客观缓解率(63.6%)也显著高于TILs治疗组(25%,P=0.002),但与化疗组(30.8%)之间无统计学差异。化疗治疗组和联合治疗组分别有8例和4例患者出现了可控的I-III度化疗相关不良反应,主要为骨髓抑制和恶心呕吐。无腹腔注射TILs相关并发症的发生。(5)不同治疗方法对卵巢癌恶性腹水患者预后的影响与联合治疗组(13个月)相比,TILs治疗组(1个月,P<0.001)和化疗(6个月,P＝0.027)的中位无进展生存时间明显缩短。同时联合治疗组患者的中位总生存时间(25个月)也明显长于TILs治疗组(7个月,P<0.001),但与单纯化疗组(18个月)相比无统计学差异。2.实验结果(1)成功制定出一套同时高效分离TILs和自体卵巢癌细胞的技术方法木实验分别采用低成本的联合酶(胶原酶、透明质酸酶、DNA酶)消化法、过滤法、半小时贴壁法、Ficoll不连续密度梯度离心法、rIL-2活化扩增法等从卵巢癌实体瘤组织或腹水中同时高效分离出TILs和自体卵巢癌细胞。(2) TILs和原代卵巢癌细胞的生长情况成功分离14例卵巢癌患者的TILs和卵巢癌细胞。初分离的TILs呈圆形,悬浮生长,随着培养时间延长,细胞可呈圆形、分支状、杆状,生长旺盛期可见细胞呈集落样生长。原代卵巢癌细胞生长较缓慢,形态多为圆形、类圆形、不规则多边形,大部分成团、成堆生长。(3) TILs活化扩增前后免疫细胞亚群的变化与初分离的TILs相比,TILs经rIL-2活化扩增第14天的CD3+、CD8+/CD3+和CD4+/CD3+TILs细胞亚群均明显增加。CD3+TILs由46.31±15.53%增加至85.544±5.54%(P<0.001),CD8+/CD3+TILs由16.31+7.49%增加至42.32±14.01%(P<9.001), CD4+/CD3+TILs由18.59±13.06%增加至31.88±10.99%(P=0.007),差异均具有统计学意义。经r1L-2活化扩增后,CD8+/CD3+TILs细胞亚群比例明显高于CD4+/CD3+TILs细胞比例(P=0.037)。(4)经r1L-2活化扩增后的TILs对肿瘤细胞显示了良好的杀伤活性初分离TILs对自体卵巢癌细胞、K562和Raji细胞的特异性和非特异性杀伤力均很低。经rIL-2活化扩增14天后,TILs细胞的特异性和非特异性杀伤活性均明显增强,对自体卵巢癌细胞的杀伤活性(54.60±11.20%)明显高于K562细胞(23.42±6.92%)和Raji细胞(19.68±5.73%),差异均具有统计学意义(P<0.001)(5)活化扩增后的TILs可有效抑制自体卵巢癌细胞分子标志物的分泌活化扩增14天后的TILs可显著抑制自体卵巢癌细胞肿瘤标志物和腹水形成因子的分泌。卵巢癌细胞经TILs处理后,其培养上清液中的CA125、VEGF、 MMP-9;水平均有明显地下降,CA125由377.21±258.44 U/ml降至165.05±132.82U/ml(P<0.001),VEGF由247.22±226.69 pg/ml降至100.22±98.26 pg/ml (P=0.003), MMP-9由211.00±156.59 pg/ml降至64.23±57.63 pg/ml (P<0.001),差异均具有统计学意义。(6)经rIL-2活化扩增后的TILs可诱导自体卵巢癌细胞发生凋亡TIL经rIL-2活化扩增14天后对自体卵巢癌细胞的致凋亡作用明显增强。与对照组(4.21±4.14%)相比,处理组卵巢癌细胞的凋亡率高达24.49±17.29%(P<0.001)。同时凋亡相关蛋白Caspase3的表达评分由杀伤前的1.57±1.40增加至杀伤后的5.21±3.70(P=0.001),阳性率由14.3%(2/14)增加至57.1%(8/14),差异具有统计学意义(P=0.018)结论1. TILs可在一定程度上改善不能或不愿接受化疗治疗的晚期卵巢癌恶性腹水患者的生活质量,甚至可以改善部分患者的预后。2.和单纯化疗相比,过继性TILs细胞联合化疗治疗卵巢癌恶性腹水不仅安全、低毒,而且在有效控制腹水的同时可以显著改善患者的生活质量。3.本实验室成功制定出一套从卵巢癌组织或腹水中同时高效分离TILs和原代卵巢癌细胞的技术路线。4. TILs经体外rIL-2活化扩增2周内均可达临床上的有效治疗剂量(x109个)。5.经rIL-2活化扩增后,CD3+、CD8+/CD3+和CD4+/CD3+TILs细胞亚群均明显增加。6.活化扩增后的TILs对肿瘤细胞具有良好的特异性性杀伤活性。7.活化扩增后的TILs可显著抑制卵巢癌细腹水形成囚子VEGF、MMP-9的合成和分泌,这可能是TILs能有效控制卵巢癌恶性腹水的原因之一。8. TILs细胞可能通过Caspase3途径诱导自体卵巢癌细胞发生凋亡。9.因此充分利用手术切除瘤组织或腹水中的TILs可成为改善卵巢癌预后的有效方法之。