论文部分内容阅读
白僵菌Beauveria bassiana是一种重要的广谱虫生真菌。然而在研究和应用过程中出现的菌株退化问题严重影响了应用白僵菌进行害虫生物防治的应用效果，也是许多科研工作者多年来致力于解决的问题。本研究采用紫外线诱变的方法筛选桑天牛高毒力株及耐吡虫啉突变株，并采用PFLP分子标记、ITS序列分析及酯酶同工酶技术研究白僵菌退化的遗传学原因，主要结果如下：（1）桑天牛幼虫高毒力白僵菌菌株紫外线诱变选育利用紫外线对前期筛选出的白僵菌菌株Bb00进行诱变选育，选出高几丁质酶突变株，再利用该突变株测定其对桑天牛幼虫的致病力，获得毒力高于出发菌株的突变株Bb00-3和Bb00-4。其中突变株Bb00-3经继代培养6次后，每代的产孢量始终高出相应代数出发菌株的2倍以上，继代过程中亦没有出现致病力的明显降低，表现出较好的遗传稳定性。（2）球孢白僵菌耐吡虫啉突变株的紫外线诱变选育在含吡虫啉的含药培养基上，利用紫外线对前期筛选出的白僵菌菌株Bb00进行诱变选育，分离筛选到抗吡虫啉的突变菌株Bb00-UVY1、Bb00-UVY4和Bb00-UVY7，三个菌株对吡虫啉的敏感性明显降低，EC50分别为原始菌株的13.35、12.40和8.84倍。四种常用杀虫剂阿维菌素、毒死蜱、灭幼脲和氯氰菊酯与突变株Bb00-UVY1和Bb00-UVY7的交互抗性更好，抑制率分别在3.08~12.10%和2.80~10.21%之间。抗药稳定性分析表明，突变菌株Bb00-UVY1和Bb00-UVY7经连续6次转接后，对吡虫啉的敏感性变化不大，表明随着传代培养其耐药性能够稳定遗传。（3）白僵菌菌株退化的RFLP及ITS序列分析对本实验用真菌的通用引物ITS4，ITS5对经过继代培养的第1、4、6、8、10、12、14、16、18和20代菌株进行特异性扩增，10代菌株均扩增出长度约580bp左右的目的片段，然后用限制性内切酶AluⅠ、BstⅪ、EcorⅠ和DraⅡ对扩增产物进行限制性酶切，产生酶切图谱，发现酶切rDNA-ITS序列的RFLP图谱差异很小，不适宜用来作为鉴定白僵菌早期退化的标准。将PCR扩增产物委托上海生物有限公司进行测序，发现球孢白僵菌不同传代菌株的ITS序列具有多态性，菌株的rDNA-ITS序列在第0~80bp和第559~570bp有碱基替换，序列的一致性达97.12%。可利用ITS-RFLP技术和扩增产物测序结果相结合的方法进行球孢白僵菌菌株退化的早期遗传检测。（4）白僵菌菌株退化的酯酶同工酶比较分析本实验利用酯酶同工酶技术分析各代白僵菌株在蛋白质水平的变异情况，结果表明：随着传代次数的增加，主要酶带一直存在且酶谱类型未变，但其酶的活性在不断减弱，尤其是几条主要酶带（A、E、C）的活性变化更为明显。从聚类图中各菌株排列次序来看，各代菌株按照传代顺序排列。与第1代菌株比较，继代次数越多其间的类间距越大，变异越大。