猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病,给养猪业造成严重的经济损失。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）作为第一个被发现的可逆的RNA修饰,已经成为畜禽表观遗传学研究领域的一个新的方向和热点。已有研究发现,m6A修饰在病毒复制与宿主免疫过程中发挥重要调控作用,然而目前关于m6A修饰对猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）抵御PEDV感染的作用及分子机制尚不清楚。本研究首先利用在组织和细胞水平上检测了不同m6A修饰酶的差异表达,筛选并确定关键m6A去甲基化酶ALKBH5可能与猪抵御PEDV感染有关,并利用RNA干扰进一步验证去甲基化酶ALKBH5与PEDV复制的关系;其次,基于转录组测序和生物信息学分析初步筛选ALKBH5可能靶向调控的基因,最后利用双荧光素酶活性、western blot以及MeRIP-qPCR分析ALKBH5介导m6A修饰对靶基因表达水平的影响,具体结果如下:1.利用RT-PCR检测临床确诊的PEDV腹泻仔猪和正常仔猪的肺组织中PDCoV、PoRV、TGEV和PEDV等引起腹泻的主要病原,结果显示,腹泻仔猪肺组织中检测出PEDV,而未发现PDCoV、PoRV和TGEV,表明PEDV可以在仔猪肺组织中进行复制;不同m6A修饰酶（METTL3、METTL14、WTAP、FTO、ALKBH5）在PEDV腹泻仔猪和正常仔猪的肺组织差异表达显示,仅仅ALKBH5在PEDV腹泻仔猪肺组织中的表达量极显著高于正常仔猪（P＜0.01）;7日龄正常仔猪组织表达谱显示,ALKBH5在不同组织中均有表达,其中肺组织表达水平最高;表明,ALKBH5表达水平可能与仔猪抵抗PEDV感染有关。PEDV毒株CV777感染3D4/21细胞36 h后,细胞出现明显的病变效应,并且ALKBH5基因mRNA和蛋白表达水平均呈现显著上升;成功建立ALKBH5基因慢病毒稳定干扰猪3D4/21细胞系,干扰效率达88%,并且干扰后PEDV-M基因拷贝数极显著高于对照组（P＜0.01）,由此表明ALKBH5表达水平上调有利于提高猪3D4/21细胞对PEDV侵染的抗性。2.利用RNA-seq技术对ALKBH5干扰前后的猪肺泡巨噬细胞进行了转录组测序分析,结果显示,测序共获得285Mb cleanreads,共鉴定出12种可变剪切类型,其中以可变末尾外显子（TTS）、可变第一外显子（TSS）和单外显子跳跃（SKIP）为主;两组之间存在175个差异表达基因DEGs,其中shALKBH5组上调78个,下调97个;DEGs共参与802个显著的GO功能分类,其中与病毒相关的GO功能注释包括病毒受体活性、病毒膜与宿主质膜融合以及参与基因GAS6、DPP4;基于转录组测序初步将GAS6作为ALKBH5可能靶向调控的候选基因。3.利用qPCR和western blot分析ALKBH5与靶基因GAS6之间的表达关系,结果显示,ALKBH5和GAS6基因表达均在PEDV感染组呈极显著上调（P＜0.01）;干扰ALKBH5后,GAS6基因mRNA和蛋白表达水平均显著下降,由此表明ALKBH5下调可以明显降低靶基因GAS6表达。此外,利用SRAMP和RMBase v2.0软件对靶基因GAS6潜在m6A修饰位点进行预测,发现GAS6编码区存在1个m6A位点（c.1469 bp）,围绕该位点分别构建突变型和野生型双荧光素酶报告载体,双荧光素酶活性显示GAS6野生型在siALKBH5组极显著下降（P＜0.01）,突变型（A1469G）活性在siALKBH5组和siNC组间不存在显著差异（P＞0.05）;利用MeRIP-qPCR检测了 shALKBH5组和shNC组间m6A水平,结果显示,shALKBH5组GAS6基因m6A水平出现极显著上升（P＜0.01）,由此表明ALKBH5通过降低靶基因GAS6m6A水平,进而提高GAS6基因表达。