葡萄糖转运体3，是葡萄糖转运体家族中的一员。生理状态下，它主要特异性地表达于神经组织，为其提供能源底物。病理状态下，GLUT3与脑血管病、某些肿瘤发生发展有着密切的关系。多种因素，例如低氧、低糖、肿瘤发生等，都可以引起GLUT3表达量的改变。但是这些因素是通过何种途径以何种方式引起GLUT3表达量的改变呢？这其中具体的表达调控机制目前尚不清楚。基因的表达调控主要可以发生在转录、转录后、翻译、翻译后等水平，但是转录调控主要的调控点。本试验将对大鼠GLUT3基因5侧翼区的转录调控序列进行分析，克隆并构建报告基因载体，为该基因的转录调控机制研究打下基础。 目的：分析大鼠GLUT3基因5侧翼区的生物信息学特征，克隆与鉴定大鼠GLUT3基因的启动子，构建大鼠GLUT3基因的启动子区的删减突变体，分析各个删去片段对启动子活性变化的影响。 方法：计算机分析阶段：从网上数据库上获得大鼠GLUT3基因的全长基因组DNA序列。用相关软件对这段序列进行相关生物信息学分析，初步预测出可能的CpG岛，第一外显子位置，转录起始点位置，启动子位置，启动子附近区域潜在的转录因子结合位点及物种间对应区段上跨物种的保守序列。实验验证阶段：根据分析结果，用PCR的方法扩增出可能的启动子区段，再定向克隆入专门用于启动子研究的无启动子的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中，从而构建出包含有大鼠GLUT3基因启动子区的荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3，并在PC12细胞和原代培养的大鼠皮层神经细胞中测定pGL3-GLUT3中扩增片段的启动子活性。之后，对验证有活性的启动子片段进行删减，构建出一系列删减突变体，再在PC12细胞内检测各删减突变体的荧光素酶表达活性，以此来研究各删去片段对启动子活性的影响。 结果： 1.初步完成对大鼠GLUT3基因5’侧翼区序列的相关生物信息学分析。CpG岛分析结果显示：大鼠GLUT3基因总共有4段序列满足CpG岛定义，其中两段位基因的5’侧翼区内。第一外显子可能位于—285～+15(以ATG为+1)，转录起始位点位于—285，以转录起始位点—285为中心上下游各200bp范围内有多条潜在的启动子序列。而且多个软件预测的结果有重叠。所以在以—285为中心上下游各—200bp范围内可能找到启动子。对这段可能包含启动子的序列进行转录因子结合位点分析时发现：这段序列上可能有结合位点的转录因子包括AML-1，AP1，C/EBP，CREBP，deltaEF1，NF—KAPPAB，p300，Sp1，SRY，TBP等在内的约90多个，其中TBP结合位点有两处，也就是有两个潜在的“TATA盒”。最后对大鼠，小鼠和人三个物种的对应区段进行比对发现：大鼠与小鼠的这段序列有76.4899％相似性，大鼠和人的这段序列有49.1877％，小鼠和人的有51.4686％。同时还发现了一些在三个物种间都高度保守的序列，且这些保守序列多为转录因子结合位点。 2.成功克隆出大鼠GLUT3基因5’侧翼区的一段长约1292bp的片段，并将其定向插入到专门用于启动子研究的pGL3-basic中，从而构建出萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3.在原代培养的神经细胞和PC12细胞中验证了其启动子活性，与转染空载体pGL3-basic相比，转染有pGL3-GLUT3的细胞内荧光素酶表达增多，表达量的差异具有统计学意义，即插入片段可以带动其后的荧光素酶基因的表达，从而证实了所克隆的片段具有启动子活性。3.对上述具有启动子活性片段的5’(或3’)端进行删减，构建出了pGL3-GLUT3-1022(—911～+111)，pGL3-GLUT3-833(—722～+111)，pGL3-GLUT3-694(—583～+111)，pGL3-GLUT3-496(—385～+111)，pGL3-GLUT3-403(—292～+111)，pGL3-GLUT3-198(—87～+111)，pGL3-GLUT3-456(—911～—455)等7个删减突变体，并在PC12细胞中检测它们的启动子活性，发现：与转染pGL3-basic组相比，转染pGL3-GLUT3-1022，pGL3-GLUT3-833，pGL3-GLUT3-694，pGL3-GLUT3-496，pGL3-GLUT3-403，pGL3-GLUT3-198等6组荧光素酶表达都有不同程度的增加，而转染pGL3-GLUT3-456组的荧光素酶表达没有增高或降低，说明—911～—455段序列没有启动子活性，核心启动子区限制在—87～+111区段内。 结论：初步完成了对GLUT3基因第一外显子5’端(转录调控区)的生物信息学分析，成功克隆出大鼠GLUT3基因含有启动子活性的片段，并构建出了一系列该段序列的删减突变体，为后续的转录调控机制研究奠定了基础。