背景糖尿病(diabetic mellitus, DM)是严重危害国民健康的重大疾病。2010年我国学者发表在《New England Journal of Medicine》对我国流行病学调查表明：20岁以上成年人DM患病人口为9240万,而DM前期患病人口约为1.48亿。而该数据在2013已被刷新。同年发表在《JAMA》上的数据显示：我国成年人DM患病人口已经达到11.6%,即中国成年人DM患病人口为1.139亿,而DM前期人口预计为为50.1%,即糖尿病前期患病人口为4.934亿。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是DM严重的微血管并发症之一,多项流行病学调查显示,DN在我国已经成为导致老年终末期肾病的首要原因,是国民健康的严重危险因素,但目前仍然缺乏对其的有效治疗手段。患者一旦发现大量蛋白尿,其肾功能将进行性下降,最终进展为终末期肾病。因此,寻找防治DN的有效药物是医学科研人员的目标,以此保证人民健康和提高患者生活治疗的迫切需求。黄连素(berberine,BBR),又名盐酸小檗碱,是从黄连、黄柏等植物中提取的生物碱。黄连素作为抗菌药已被临床广泛应用于痢疾杆菌所致的肠道感染。近年来研究发现该药尚能治疗DM、高血压及心律失常等心血管疾病。关于黄连素对DN的研究越来越受关注。已有一些对黄连素治疗DN的疗效观察及机制研究,多从改善胰岛素抵抗,降低血糖,降低血压和血脂,抗炎及改善氧化应激等方面研究。但目前缺少对黄连素干预2型DN的长期疗效观察及作用机制研究。李平教授研究团队在前期差异蛋白质组学中发现,二氢生物喋呤还原酶(dihydropteridine reductase, QDPR)在自发性2型糖尿病模型OLETF大鼠肾脏损害时,编码此蛋白的基因发生点突变。进一步研究发现,QDPR可以增加BH4和nNOS基因表达,下调TGFβ1,Smad3以及NOXs各亚基的蛋白和基因表达,进而发挥对肾脏的保护作用；在体外高表达QDPR可以增强自噬相关基因的表达,增强自噬活性。因此,QDPR可能作为DN的潜在生物标记物和药物作用靶点,对QDPR启动子的研究势在必行。目的观察黄连素对于高脂饲料联合低剂量STZ诱导2型DN大鼠模型的肾脏保护作用,及其机制是否与抑制炎症、纤维化和改善脂代谢紊乱有关；构建DN相关基因QDPR启动子片段,对其启动子区域定位,观察黄连素对其活性影响。方法1.黄连素对2型DN大鼠的肾脏保护作用及机制1.1黄连素对2型DN大鼠的肾脏保护作用：本实验通过高脂饲料联合低剂量STZ诱导2型DN大鼠模型,给予黄连素连续灌胃给药20w。动态监测实验大鼠测血糖水平,4周一次；每4周收集实验大鼠24h尿；20周时处死实验动物,腹主动脉取血,收集血清,日立全自动血生化仪测定各项血生化指标；收集肾组织用一半用于组织病理学染色,其余肾组织用于分子生物学检测。1.2黄连素通过抑制NF-κB通路减轻2型DN大鼠肾脏炎症：对高脂饲料联合低剂量STZ诱导2型DN大鼠模型,进行免疫组织化学,western blot以及realtime PCR等方法检测炎症指标(ED-1、IL-1β、TNF-α和MCP-1),并研究NF-κB炎症信号通路(p-p65、p65、p-IκBα、IκBα)。1.3黄连素通过抑制TGFβ/Smad通路减轻2型DN大鼠肾脏纤维化：对高脂饲料联合低剂量STZ诱导2型DN大鼠模型,进行免疫组织化学,western blot以及realtime PCR等方法检测纤维化指标(collagen Ⅰ、collagen Ⅳ和Fibronectin),并研究TGFβ/Smad信号通路(TGFβ、pTβRI、TβRI、TβRⅡ、p-Smad2/3, Smad2/3, Smad7, Smurf2)。1.4黄连素通过调节LOX-1/ABCA-1平衡改善2型DN大鼠肾脏脂质沉积：对高脂饲料联合低剂量STZ诱导2型DN大鼠模型,进行油红O染色, western blot以及realtime PCR等方法检测胆固醇摄入及流出指标(LOX-Ⅰ、RXRa、RXRβ和ABCA-1)。2.黄连素对QDPR启动子功能区域影响初探2.1 QDPR启动子功能区域的构建：从GenBank数据库获取大鼠QDPR基因组序列,利用启动子在线分析软件(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/) (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)对该基因起始密码子ATG 5’上游约2kb的序列进行分析,对启动子区域潜在的转录因子结合位点进行预测。采用DNAStar软件进行DNA序列对比和酶切位点分析。利用T-A载体进行克隆,而后亚克隆至pGL3-Basic表达载体,利用酶切鉴定及测序分析判断启动子构建正确与否。2.2黄连素对QDPR启动子功能区域的影响：黄连素(浓度为5nM,10μM)干预高糖(30mM)刺激瞬时转染有QDPR启动子不同片段的HEK293T细胞,通过双萤光素酶报告基因活性分析,分析黄连素对于QDPR基因启动子活性的影响。结果1.黄连素对2型DN大鼠的肾脏保护作用及机制1.1黄连素对2型DN病大鼠的肾脏保护作用：实验期间,Normal组大鼠血糖水平稳定在正常水平；造模成功后DN组大鼠血糖维持在高水平,黄连素治疗第4周开始降低大鼠血糖水平,其作用可持续至实验终点。实验结束取材时,DN组大鼠肾重指数明显高于Normal组大鼠,黄连素治疗可显著改善升高的肾重指数；DN大鼠血清总蛋白及白蛋白水平降低,尿素氮水平升高,而血肌酐水平未见明显变化；在给予黄连素治疗后,白蛋白水平上升,尿素氮水平下降。DN大鼠尿微量白蛋白水平随着实验进展而上升,在给予黄连素治疗第8周开始下降,并持续至第20周。病理染色可见Normal组大鼠肾小球结构正常,肾小管结构清晰,背靠背排列紧密,肾小管上皮细胞排列整齐,间质未见炎性细胞浸润。DN组大鼠肾小球官腔结构异常,系膜基质增生显著,基底膜增厚；肾小管上皮变性,部分肾小管官腔扩张,间质有大量炎性细胞浸润：黄连素治疗明显减轻DN大鼠肾脏病理改变。1.2黄连素通过抑制NF-κB通路减轻2型DN大鼠肾脏炎症：在高脂联合STZ诱导的2型DN大鼠模型肾脏炎症浸润明显,在肾小球及肾小管间质充斥巨噬细胞；给予黄连素治疗后,浸润的巨噬细胞明显减少。相似地,一些反应炎症状态的指标,如MCP-1, TNF-α及IL-1β在DN模型大鼠肾脏中表达升高,而黄连素治疗能够显著减少上述指标的基因及蛋白水平表达。进一步研究发现,在DN模型大鼠肾脏中,磷酸活化的NF-κB(p-p65)蛋白水平上升,而磷酸化的IκBα (p-IκBα)表达减少。1.3黄连素通过抑制TGFβ/Smad通路减轻2型DN大鼠肾脏纤维化：2型DN进展到20周时,肾脏纤维化明显：collagen Ⅰ, collagen Ⅳ以及Fibronectin在mRNA及蛋白水平都显著升高；黄连素治疗能够显著改善DN肾脏纤维化。进一步研究发现,DN大鼠肾脏中磷酸化的TβRⅠ表达增强,TβRⅡ的改变具有上升趋势。此外,致病性Smad3磷酸活性增强,保护性Smad7表达降低,促进Smad7降解的Smurf 2表达上升。黄连素治疗能够降低磷酸化TβRI、磷酸化Smad3及Smurf 2表达,增加Smad7表达,从而抑制纤维化。1.4黄连素通过调节LOX-1/ABCA-1平衡改善2型DN大鼠肾脏脂质沉积：在高脂饲料联合低剂量STZ诱导的2型DN大鼠模型表现出明显的血脂紊乱,包括血液循环中显著升高的甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇,高密度脂蛋白胆固醇的变化虽无统计学意义,但表现出下降趋势。油红O染色发现2型DN大鼠肾脏局部存在大量脂滴沉积。给予黄连素治疗后,病变大鼠的脂代谢紊乱得以显著改善。进一步的机制研究发现,DN状态时LOX-1表达上升而ABCA-1表达下降,造成胆固醇摄取和转运失衡,继而发生脂代谢紊乱；给予黄连素治疗后,能够下调LOX-1表达,上调ABCA-1及其调节受体LXR/RXR表达。2.黄连素对QDPR启动子功能区域影响初探2.1 QDPR启动子功能区域的构建：本实验成功构建含有大鼠QDPR基因翻译起始位点上游2092bp序列的萤光素酶报告基因重组质粒,同时构建该区域缺失片段的萤光素酶报告基因重组质粒,通过酶切及测序鉴定确认成功构建大鼠QDPR基因启动子片段。2.2黄连素对QDPR启动子功能区域的影响：在高脂联合低剂量STZ诱导的2型DN大鼠模型肾脏中,QDPR表达减少；同样地,在体外使用高糖诱导HBZY细胞,QDPR表达降低。高糖刺激HEK 293T细胞,QDPRp1 (QDPR启动子全片段)的荧光素酶活性显著降低,而QDPRp2 (QDPR启动子部分缺失片段)的荧光素酶活性显著升高。然而在给予黄连素干预高糖刺激后的HEK293T细胞后,QDPRp1应答明显增强,并且作用呈剂量依赖性；相反地,给予黄连素治疗后的QDPRp2应答减弱。结论1.黄连素对2型糖尿病大鼠的肾脏保护作用及机制：黄连素治疗高脂饲料联合低剂量STZ诱导的2型DN大鼠,可显著降低肾重指数、血糖、血脂以及尿微量白蛋白。黄连素是通过抑制NF-κB介导的炎症,抑制TGFβ/Smad介导的纤维化,以及改善胆固醇的摄入与流出平衡发挥对2型DN大鼠的肾脏保护作用。2.黄连素对QDPR启动子功能区域影响初探：QDPR在DN状态下,表达减少；通过对大鼠QDPR基因启动子的初步研究,定位QDPR基因启动子核心区域,黄连素可通过对大鼠QDPR基因启动子的作用影响QDPR在DN状态时表达的变化。