目的:一、为膈神经端侧吻合迷走神经重建高位颈髓损伤患者呼吸功能提供人体解剖依据二、采用免疫组织化学方法研究人体膈神经及迷走神经各段的运动纤维数量。三、寻找膈神经端侧吻合迷走神经的最佳位置,及最佳手术入路。四、建立膈神经端侧吻合迷走神经重建高位颈髓损伤大鼠呼吸功能的实验模型。五、监测膈神经端侧吻合迷走神经后大鼠颈髓横断前后的血气分析变化。六、利用B型超声监测膈神经端侧吻合迷走神经后高位颈髓损伤大鼠膈肌活动度的变化七、探讨膈神经端侧吻合迷走神经后高位颈髓损伤大鼠膈肌肌电图的变化特点。八、利用辣根过氧化物酶示踪技术探寻膈神经端侧吻合迷走神经后高位颈髓损伤大鼠膈神经与中枢神经系统的联系。通过本实验探讨膈神经端侧吻合迷走神经重建高位颈髓损伤大鼠呼吸功能的可行性。为临床重建高位颈髓损伤患者的呼吸功能探讨新方法,提供理论指导。方法:一、选取20具（38侧,2侧标本损坏）福尔马林固定的成人标本,解剖并观察迷走神经、膈神经的走形特点,测量迷走颈部及胸部的神经、膈神经的长度、宽度及厚度,及其相互关系。二、选取膈神经及迷走神经神经各特定位置的标本,采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法对迷走神经与膈神经染色,进行神经纤维形态学观察,并对胆碱乙酰移换酶单克隆抗体（choline acetylase, CHAT）以及神经纤维单克隆抗体（Neurofilament）阳性表达的神经纤维应用PV-9000病理图文分析系统进行定量分析。三、动物模型建立:每组实验选取健康雄性SD大鼠15只（购于中科院上海研究所）,体重180～200g。随机分为A、B、C三组,每组5只。A组为膈神经端侧吻合迷走神经组,B组为膈神经原位吻合组,C组为空白对照组。将A组5只大鼠腹腔麻醉后,钝性分离迷走神经及膈神经干。将存在副膈神经的大鼠剔除,于颈6水平游离膈神经,锐性切断。将膈神经远侧断端用11-0医用无损伤针线端侧吻合至迷走神经。同法进行对侧手术。将B组大鼠腹腔麻醉后,暴露膈神经干,将存在副膈神经的大鼠剔除,于颈6水平游离膈神经,锐性切断。然后用11-0医用无损伤针线将离断膈神经重新吻合。同法进行对侧手术。将C组大鼠应行腹腔麻醉后,仰卧位固定于动物手术台。10%硫化钠脱毛,消毒手术野后铺巾。取锁骨下切口暴露膈神经,不行任何操作,撒青霉素粉剂后关闭手术切口,术后不作任何外固定,任其自由活动。进行脊髓横断实验时,将上诉大鼠饲养10个月后,于C3/4水平横断脊髓。进行各项指标测量。四、术后10个月,将A、B各组大鼠麻醉后,仰卧位固定于动物手术台上。暴露膈肌及双侧迷走神经吻合段。用双极电极作为刺激电极置于神经吻合口的近、远端2mm处进行刺激,同芯针电极为记录电极,插入膈肌的五个不同测量部位,对膈神经对膈肌的重新支配情况进行全面的评估。分别记录波幅及传导速度,信号经放大后打印记录以备后续分析。将五只大鼠的5个位置的神经传导速度、潜伏期及波幅的平均值作为测量结果。C组大鼠选择与B组吻合口相同的位置作为刺激电极置入的位置,记录电极的位置与A、B组相同。同种方法测量对侧。完成上述测量后,将A、B、C三组大鼠取颈后正中切口,切除颈3全椎板并于颈3、4水平锐性横断脊髓。同法测量三组大鼠波幅及神经传导速度的变化,与颈髓横断前测量结果相对比。五、饲养10个月后,分别将A、B、C各组大鼠行腹腔麻醉,仰卧位固定于动物手术台。取腹正中切口,显露腹主动脉,顺血流方向插入肝素化的特制软硅胶管,分别抽取动脉血各0.2ml,进行pH值、氧分压(P_o2)、二氧化碳分压(P_co2)及血氧饱和度(S_O2)的监测。然后取颈后正中切口,切除颈3全椎板并于颈3水平锐性横断脊髓。在颈3、4脊髓横断后1h、2h、3h、4h抽取动脉血进行pH值、氧分压（Po2）、二氧化碳分压（Pco2）及血氧饱和度（SO2）的监测。同时监测C组正常大鼠作为对照组,分析膈神经端侧吻合迷走神经后后高位颈髓损伤大鼠血气分析指标的变化特点,以及正常值维持时间。六、术后10个月,将A、B、C三组大鼠腹腔麻醉后,将大鼠四肢向两侧牵引仰卧位固定于动物手术台。我们选择1、剑突下;2、肋前;3、肋中三点应用B型超生寻找膈肌,录制三个周期的平静呼吸下膈肌动态图,将其超慢回放,分别寻找膈肌平静呼吸下呼气末及吸气末位置,两者距离即为此位置下的膈肌动度。每只大鼠的每个位置按上述方法测量5次,取每次的平均值为改点的膈肌运动幅度,再将三点的测量值取平均值作为该大鼠膈肌运动度的最后值I。将C组大鼠膈肌运动幅度的变化IC设定为正常大鼠膈肌运动幅度。A组大鼠膈肌运动幅度恢复率（IA/IC）=A组大鼠膈肌运动幅度值IA/C组大鼠膈肌运动幅度值IC;B组大鼠膈肌运动幅度恢复率（IB/IC）=B组大鼠膈肌运动幅度值IB/C组大鼠膈肌运动幅度值IC;完成上诉实验测量后,将A、B大鼠于颈3水平锐性横断脊髓。30分钟后按照前述方法重新测量膈肌的运动幅度变化。设定颈3脊髓横断后大鼠膈肌运动度的最后值为V。仍将C组大鼠膈肌运动幅度的变化IC设定为正常大鼠膈肌运动幅度。颈髓横断后A组大鼠膈肌运动幅度恢复率（VA/IC）=A组大鼠膈肌运动幅度值VA/C组大鼠膈肌运动幅度值IC;颈髓横断后B组大鼠膈肌运动幅度回复率（VB/IC）=B组大鼠膈肌运动幅度值VB/C组大鼠膈肌运动幅度值IC;七、术后10个月,将A组大鼠腹腔麻醉后,显露双侧膈神经干及神经吻合口。在膈神经干上距吻合口1cm处,沿神经纤维走行方向用微量注射器将1%CB—HRP注入膈神经干内,然后灌注、固定、取材、制片、染色。观察疑核内是否染色。结果:一、颈部迷走神经与膈神经较易显露且位置较近,容易吻合。胸部迷走神经暴露相对较难,但由于其分支较多,选取其中一支与膈神经移接对迷走神经功能无影响,且能大大减少神经纤维再生距离。在颈部,迷走神经神经纤维的总体数量远大于膈神经,且随着向胸腔的延伸数量逐渐增加。迷走神经内运动神经纤维数量只占神经纤维重量的1/3左右,但与膈神经内运动神经纤维数量接近。而在胸部迷走神经与膈神经神经纤维总量相近,运动纤维数量为膈神经的1/3左右。二、颈髓横断前A组与B组的神经传导速度恢复率、潜伏期及波幅恢复率与C组有显著的统计学差别（P﹤0.05）。A组与B组的波幅恢复率较神经传导速度恢复率高。颈髓横断后B、C两组大鼠迅速死亡,无法测量。A组大鼠的神经传导速度及潜伏期与颈髓横断前无统计学差异。但颈髓横断后A组大鼠波幅较颈髓横断前有明显升高接近正常对照组。三、A、B、C三组的各项指标基本接近,无统计学差异（P>0.05）。颈3脊髓横断后B组大鼠全部死亡,A组大鼠颈3脊髓横断2小时后血气分析指标维持在正常范围之内,无呼吸困难。3小时后大鼠出现轻度的CO₂潴留,大鼠呼吸频率增快,部分大鼠呼吸变浅。4小时后,一只大鼠死亡,三只大鼠呼吸浅快,氧饱和度急剧下降,并出现严重的呼吸性酸中毒,在20分钟内相继死亡。仅1只大鼠存活时间超过5小时。四、颈髓横断前A、B组大鼠的膈肌运动恢复率分别为92.18±4.27%、90.46±6.73%,二者无统计学差异（P>0.05）。颈髓横断后,B组大鼠呼吸消失,膈肌活动度为0。A组大鼠在颈髓横断后出现短暂的呼吸抑制,而后胸式呼吸消失,以腹式呼吸为主。膈肌运动幅度明显增强,个别大鼠的呼吸活动度甚至超过了C组大鼠的运动幅度。五、5只大鼠中有3只大鼠染色较清晰,一只未染色,一只染色较差。CB-HRP的反应产物在明亮视野下呈青兰色,标记的细胞和轴突的形态显示良好。逆行标记的细胞胞体和树突中的产物呈颗粒性,在疑核中,反应产物呈均质性或排列极为密集的小颗粒,神经元胞体结构清晰,标记轴突内的产物也为均质性。结论:颈部迷走神经与膈神经位置较近,相对表浅易暴露,且迷走神经内运动神经纤维含量与膈神经相似,适宜吻合。膈神经端侧吻合迷走神经后,膈神经纤维能较好的再生,并建立膈神经-迷走神经-疑核通路,有效的维持高位颈髓损伤大鼠的呼吸功能。