鲜切生菜中沙门氏菌的生长预测及渗透抗逆境应答基因rpoS对沙门氏菌的影响

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沙门氏菌是一种分布广泛的食源性致病菌,严重影响着人们的健康和国民经济的发展。为了控制其危害,本文选用已经全基因测序的模式菌株Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344,及本研究构建的rpoS基因缺失的SL1 344菌株SL1344/△rpoS,和分离自食品中的野生菌株LQG-1进行微生物应急生长调控的研究。首先对SL1344进行驯化,使其能够在只有葡萄糖能够提供碳源的BMM培养基中稳定生长;并将已驯化的SL1344菌株进行周期性高渗刺激,探究沙门氏菌延滞期的变化情况;接着以SL1344为原始菌株,采用λred同源重组技术构建逆境应答相关基因rpoS基因缺失的沙门氏菌菌株SL1344/△rpoS。同时,以并从生鲜猪肉中分离得到沙门氏菌野生菌株LQG-1为研究对象,对其进行鉴定,并将SL1344、SL1344/△rpoS及LQG-1的生长在逆境中进行比较,探究rpoS在渗透应答中在转录层面的调控方式和变化,说明在鲜肉与鲜切生菜交叉感染沙门氏菌后,rpoS对生长动力学参数的影响作用。为说明环境周期性变化对微生物适应力的影响,对SL1344进行研究。结果表明(1)经驯化的SL1344连续3~4次传代,当初始菌量相同时,其达到稳定期时菌量的数量级也相同,说明SL1344能够在只有葡萄糖提供碳源的BMM培养基中稳定生长;(2)已驯化好的菌株SL1344在NaCl浓度为3%、3.5%、4%和5%的BMM中培养,根据其延滞期初始下降幅度及生长周期长短的比较结果,确定适宜的NaCl的添加浓度为3.5%;(3)已驯化且未经渗透处理的SL1344在含3.5%NaCl、0%NaCl的BMM中周期性交替的培养,并观察其在BMM-NaCl中的生长情况,结果发现SL1344首次在BMM-NaCl中培养,即为第0次转移,其延滞期初始下降幅度最大,生长至稳定期所需时间最长。随着转移次数的增多,延滞期的初始下降幅度越来越小,到第4次转移时几乎为零。为研究逆境应答基因rpoS对实际食品中沙门氏菌生长的影响情况,通过λ red同源重组技术,构建SL1344/△rpoS;从实际食品生鲜猪肉中分离得到LQG-1,并对其进行鉴定。结果显示:(1)构建SL1344/ArpoS菌株过程中,用同一对引物鉴定,rpoS基因PCR扩增产物片段、替换后扩增片段及消除后扩增片段分别为1344bp、1432bp、500bp左右,证明rpoS基因缺失菌株SL1344/ArpoS构建成功; (2)对LQG-1进行鉴定,其菌体短杆状、无芽孢、革兰氏染色呈阴性,经16SrDNA序列进行分析,确定其为沙门氏菌。为探索rpoS基因与实际食品中沙门氏菌生长的影响,将SL1344、 SL1344/△rpoS和LQG-1分别接种于LB肉汤、含NaCl 3.5%的BMM以及鲜切生菜上,以Baranyi建立得到其一级模型,拟合得到其生长动力学相关参数,比较延滞期和最大比生长速率,可以得知:(1)LB液体培养基中,三菌株生长基本同步;(2)在含3.5%NaCl的BMM中,SL1344比SL1344/△rpoS更容易适应新环境; (3)在生菜上,LQG-1来源于食品,更易在实际食品中建立新的循环,适应新环境。SL1344菌株有小幅度的生长,SL1344/△rpoS几乎不生长,在一段时间后逐渐衰亡。
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