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生长分化因子 8(growth differentiation factor 8,GDF-8)又称肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是一种肌肉生长负反馈因子,主要在骨骼肌中高水平表达。GDF-8基因自然或人工突变的动物都表现出骨骼肌过度肥大的现象,肌肉含量显著增加,对肉畜养殖业具有重大的经济价值。基因编辑技术是研究基因功能的一种重要方法。近年来,CRISPR-Cas系统凭借其灵活、便捷、快速、耗费低的特点广泛应用在多种动植物的基因编辑中。CRISPR-Cas系统是来源于古细菌中的一种核酸酶与非编码小RNA构成的复合物,其主要依靠单链向导RNA(SgRNA)结合在基因上的特定序列,从而实现对靶向DNA序列位点实行切割,引起DNA双链断裂(DSBs),继而在细胞自身DNA修复机制的作用下,完成基因编辑。本研究运用CRISPR-Cas9系统对加利福尼亚兔(简称兔)GDF8基因进行基因编辑。首先在外源基因上对选定的位点进行编辑效率的验证,其次在兔成纤维细胞上进行编辑效率的验证,然后在兔受精卵注射Cas9mRNA和SgRNA,培养至囊胚期进行编辑效率的验证,最后将显微注射过的受精卵移植回母兔输卵管,以期获得基因编辑兔。主要研究结果如下:(1)成功构建了由hSpCas9真核表达载体和gRNA真核表达载体组成的基因打靶系统,且通过在细胞和胚胎层面的检测验证了其可以准确的对靶位点进行基因编辑。(2)在兔GDF8基因上成功筛选到了两个可以高效结合gRNA真核表达载体的靶位点E1和E2。通过RGS-CR报告载体在HEK293T细胞转染实验中的检测及流式细胞仪的分析,两个gRNA位点均可高效率的介导形成DSBs,其中gRNAE1的效率达到了 64.0%,gRNAE2的效率略高于E1,达到了 64.4%。(3)成功分离到了兔原代成纤维细胞,并运用构建的打靶系统在兔成纤维细胞上实现了对GDF8基因的编辑。T7E1酶切鉴定结果表示gRNAE1在成纤维细胞上的编辑效率为27.1%,gRNAE2在成纤维细胞上的基因编辑效率为7.4%。测序结果表明gRNAE1的编辑效率达到了 45.3%,gRNAE2在兔成纤维细胞上的基因编辑效率为25.0%(4)运用构建的打靶系统在兔一细胞期胚胎上成功实现了对GDF8基因的编辑。选用双位点基因打靶的策略,通过体外转录获得hspCas9mRNA和sgRNA,然后按100:50ng/μL的浓度比显微注射到兔一细胞期胚胎中,并培养至囊胚期,通过巢式PCR扩增进行测序验证,测序结果表明,gRNAE1和gRNAE2共同打靶在兔内源胚胎上的编辑效率达到了 20.0%。(5)运用构建的打靶系统生产转基因兔,本次一共移植了 28枚胚胎至两只母兔,十天后通过触诊判断两只均妊娠,其中一只在孕期21天时流产,流出了 6只死胎,另一只在孕期23天时流产,流出3头死胎。剪取这九只死胎的大腿肌肉组织,提取组织基因组,进行PCR扩增以及测序验证。测序结果表明,未在靶位点检测到基因突变的现象。