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目的研究蛋白激酶WEE1和钙调蛋白激酶CAMK1G对胃癌细胞生长增殖迁移的影响和其作用机制,为探讨CAMK1G-WEE1调节轴对胃癌细胞的调控机制奠定实验基础。方法1、利用胃癌组织芯片和免疫组织化学染色观察WEE1在癌组织和癌旁组织的表达情况。2、体外培养正常的胃上皮细胞GES-1和胃癌细胞SGC-7901、BGC-823。3、Western Blot检测CAMK1G和WEE1在三株细胞中的本底表达,选择WEE1高表达细胞加入MK1775进行后续实验。4、WEE1抑制剂MK1775相关实验分为空白对照组,DMSO对照组和MK1775组。5、MTT筛选出合适的MK1775浓度,分别用5 nmol/L、10 nmol/L、20nmol/L和40 nmol/L的MK1775处理BGC-823细胞。6、划痕实验检测MK1775对胃癌细胞BGC-823迁移的影响。7、克隆形成实验检测MK1775对胃癌细胞BGC-823增殖的影响。8、Western Blot检测MK1775处理BGC-823细胞后CAMK1G的表达和CDK1 T-14、CDK1 Y-15磷酸化状态及EMT激活剂(SNAL1、SNAL2和TWIST1)表达情况。9、基因转染:采用转染试剂Lip 2000将CAMK1G质粒转入胃癌细胞BGC-823中。实验分为未转染组、空载体转染组、CAMK1G基因转染组。10、MTT实验检测过表达CAMK1G后胃癌细胞BGC-823细胞生长曲线。11、克隆形成实验检测过表达CAMK1G后胃癌细胞BGC-823的增殖情况。12、划痕实验检测过表达CAMK1G后胃癌细胞BGC-823的迁移情况。13、Western Blot检测SNAL1、SNAL2和E-cadherin蛋白表达。结果1、免疫组织化学结果显示,WEE1在癌组织中表达明显高于癌旁组织(p<0.01),并且随着临床分期增加而WEE1表达增加。2、Western Blot结果表明WEE1在SGC-7901和BGC-823细胞中均有表达且在BGC-823中最为明显,而在GES-1中几乎没有表达。我们选择WEE1高表达的BGC-823细胞进行后续实验。3、MTT检测不同浓度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L)MK1775处理BGC-823细胞的生长曲线。MK1775呈时间和浓度依赖性变化。后续实验选择40 nmol/L MK1775作为最适浓度处理BGC-823细胞。4、划痕实验结果观察到MK1775处理组BGC-823细胞迁移能力低于空白组和DMSO对照组(p<0.01)。5、克隆形成实验结果观察到MK1775处理组BGC-823细胞增殖数量明显少于空白组和DMSO对照组(p<0.01)。6、Western Blot检测结果观察到MK1775处理组CAMK1G表达减少,CDK1T-14和CDK1 Y-15的磷酸化状态减弱(p<0.01)。EMT激活剂(SNAL1、SNAL2和TWIST1)蛋白表达减少(p<0.01)。7、Western Blot检测CAMK1G本底表达显示,CAMK1G在SGC-7901和BGC-823细胞中表达明显高于GES-1,并且在BGC-823细胞中表达最高(p<0.01)。8、MTT实验检测过表达CAMK1G后,BGC-823随时间变化增殖能力增强(p<0.01)。9、克隆形成实验结果观察到,过表达CAMK1G后BGC-823细胞增殖数量明显高于空白组和pcDNA3.1空载体转染组(p<0.01)。10、划痕实验结果观察到,过表达CAMK1G后BGC-823细胞迁移能力明显高于空白组和pcDNA3.1空载体转染组(p<0.01)。11、Western Blot检测过表达CAMK1G后BGC-823细胞中SNAL1、SNAL2蛋白表达增加p<0.01),E-cadherin蛋白表达减少(p<0.01)。结论1、WEE1抑制剂MK1775通过调控EMT标志物(SNAL1、SNAL2、TWIST1)抑制胃癌细胞株BGC-823的增殖和迁移。2、过表达CAMK1G通过调控EMT标志物(SNAL1、SNAL2、E-cadherin)促进胃癌细胞株BGC-823的增殖和迁移。