论文部分内容阅读
本研究首先筛选了鲢鱼卵小分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)的最适粗提取条件。在此基础上,综合运用各种层析及电洗脱方法,分离纯化了两种鲢鱼卵小分子CPIs,分别命名为类Stefin-Ⅰ和类Stefin-Ⅱ。并通过Tricine-SDS-PAGE及C18的RP-HPLC鉴定了它们的分子量和纯度。此外,对其部分生物学活性特征进行了鉴定,为进一步深入研究鲢鱼小分子CPIs奠定基础。最后,通过监测pH、TVB-N、剪切力、鱼肉组织蛋白酶B (Cathepsin B)和组织蛋白酶L (Cathepsin L)活性、鱼肉组织微观结构等指标,初步探讨了鲢鱼卵类Stefin-Ⅰ在冷藏鲢鱼肉片保鲜中的作用。鲢鱼卵小分子CPIs最适粗提取条件的筛选：在匀浆步骤,以比活值为标准确定了最适的匀浆缓冲液,即含0.1mmol/L PMSF的20mmol/L磷酸盐缓冲液,pH 6.0的缓冲液I。进一步通过比较不同热和酸处理后的CPIs的比活,同时结合SDS-PAGE电泳结果,筛选出小分子CPIs的最佳酸处理条件为匀浆液4℃静置1h,pH 3.0酸处理10min后用1mol/L NaOH回调至pH 8.0。在超滤浓缩步骤,通过SDS-PAGE分析发现,先经30 kDa超滤浓缩,取下清再经5kDa超滤得最终粗提浓缩液,该法对分离富集小分子CPIs十分有效。鲢鱼卵小分子CPIs的纯化鉴定：对制备的鲢鱼卵小分子CPIs (30-5 kDa)浓缩粗提液进行层析纯化,以灵敏度较高的荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)法监测CPIs的抑制活性。取Sp Sepharose Fast Flow阳离子交换层析的有活性的吸附部分,进行下一步Octyl-Sepharose 4 Fast Flow疏水层析,结果得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ六个活性峰。本实验主要针对比活较高的峰II和峰III进行深入研究。峰II在还原性Tricine-SDS-PAGE上主要呈现五条带,与其过Sephadex G-50葡聚糖凝胶层析所得的蛋白峰基本一致,对Sephadex G-50获得的分子量最小的组分(命名为类Stefin-Ⅰ)进行电泳鉴定,与Papain反应前后,在Tricine-SDS-PAGE上均呈现5.921 kDa的单一蛋白条带。RP-HPLC鉴定类Stefin-Ⅰ纯度,表明其在保留时间14.424min(峰面积89.56%,拖尾因子1.218)处出现单一峰。类Stefin-Ⅰ对鲢鱼Cathepsin B、Cathepsin L及Papain均具抑制活性,但是对Trypsin和Chymotrypsin不具抑制活性；在pH 4.0-pH 9.0条件下稳定,残余抑制活性均在60%以上；4-50℃稳定,残余抑制活性均在80%以上。利用Dixon-plot作图法测得其Ki值为0.143nM,属非竞争性抑制剂。峰Ⅲ在还原性Tricine-SDS-PAGE上呈现两条蛋白带(17.531 kDa和6.352kDa),经与Papain反应后的电泳鉴定表明均为抑制因子条带。利用电洗脱获得的6.352 kDa的类Stefin-Ⅱ。RP-HPLC上在保留时间14.198min(峰面积49.91%,拖尾因子1.339)和92.729min(峰面积30.26%,拖尾因子1.688)处呈现两个蛋白峰。类Stefin-Ⅰ对冷藏鲢鱼肉片保鲜作用的初探研究表明,类Stefin-Ⅰ(1920 units/mg)涂抹于4+0.5℃冷藏的鲢鱼肉片表面,在冷藏8d内鲢鱼肉片pH值、TVB-N值、剪切力值及鱼肉组织微观结构等指标变化趋势均优于对照组。冷藏期间,实验组肉片达到最低pH值的时间(3d)比对照组(2d)延长,而且在贮藏3d后,尽管pH值均呈上升趋势,但实验组pH值一直极显著低于对照组(p≤0.01)。实验组和对照组TVB-N值及剪切力值在贮藏前2d差异不显著(p≥0.05),3d后剪切力发生明显下降,对照组和实验组TVB-N值分别在3d和4d时,发生显著(0.01印≤0.05)上升,但3-8d内,实验组肉片的TVB-N值及剪切力值显著(0.01印<0.05)低于或高于对照组。Cathepsin B、Cathepsin L活性在4±0.5℃冷藏8d内均呈上升趋势,其中,4d时对照组Cathepsin L活性显著(0.019≤0.05)高于实验组。而在贮藏的各个时间点上,对照组Cathepsin B活性均极显著(p≤0.01)地高于实验组,说明涂抹类Stefin-Ⅰ主要对鱼肉片内源或腐败微生物分泌的Cathepsin B活性起到了显著的抑制作用。冷藏0d鱼肉片肌肉纤维状结构清晰可见,2d时对照组和实验组差异不显著,3d时,实验组鱼肉片肌肉纤维虽然发生一定程度的蛋白降解,但是结构仍然完整,而对照组的肌肉的纤维状结构被明显破坏。6d时实验组鱼肉纤维也发生了明显的断裂,而对照组则纤维结构丧失,表面模糊。8d时两组鱼肉纤维结构都消失,但实验组仍好于对照组。因此,将纯化的类Stefin-Ⅰ涂抹于鲢鱼肉片,可在一定程度上延缓冷藏期间鱼片的软化和自溶速度,维持鱼片的品质,起到一定的保鲜作用。