丙酮酸作为一种重要的化工原料,广泛应用于材料、食品、医药和化妆品等领域。生物发酵法作为生产丙酮酸的一种生产方式有着低成本且环保的优势。然而,目前利用微生物发酵生产丙酮酸的方法仍有缺陷,如糖酸转化率不高、胞内氧化还原水平不平衡等问题。本论文拟通过基因敲除的手段构建一株能够积累丙酮酸的大肠杆菌,并以基因敲除后胞内还原力不平衡为突破口达到提高丙酮酸产量的目的。主要研究内容及结果如下:（1）以一株具有工业化产D-乳酸能力的大肠杆菌HBUT-D为出发菌株,构建了产丙酮酸的工程菌株。首先采用RED技术敲除了乳酸脱氢酶基因（ldh A）和丙酮酸氧化酶基因（pox B）,以阻断丙酮酸向D-乳酸和乙酸等副产物的转化。其次,删除琥珀酰Co A合成酶基因（suc CD）可以达到激活乙醛酸途径和削弱TCA循环的目的,尝试删除suc CD基因来增加丙酮酸的积累;最后,尝试敲除ATP合成酶基因部分亚基（atp FH）减少ATP的合成,从而提高糖酵解的强度和丙酮酸的产量。摇瓶发酵结果发现,在同时敲除了ldh A和pox B基因的HBUT-P2菌株由于缺乏大部分的丙酮酸分解途径,使得丙酮酸能够积累至19.56 g/L,产率可达0.79 g/g。而atp FH和suc CD基因的缺失均会导致菌株生长能力和产丙酮酸的能力下降,不利于丙酮酸的积累。（2）由于副产物合成途径的删除会提高胞内NADH含量,抑制糖酵解途径,从而影响丙酮酸产量。为进一步提高丙酮酸的产量,采用三种不同的方法调控HBUT-P2菌株胞内的氧化还原水平。首先在基因水平上,过表达来自E.coli W3110的可溶性吡啶核苷酸转氢酶基因（udh A）将NADH催化为NAD⁺来调控胞内氧化还原水平。采用退火缓冲液的方法优化了SLi CE无缝克隆的方法,成功将udh A基因克隆到高拷贝质粒p UC19的原lac Zα基因位点,随后以6%葡萄糖作为碳源进行丙酮酸发酵。当发酵进行到8 h加入1 mmol/L的IPTG诱导表达udh A基因。与对照组HBUT-P2/p UC19相比,过表达了udh A基因的工程菌的丙酮酸的生产强度提高了约32.35%,糖酸转化率也提高了10.80%,而产量无明显提高。（3）在发酵水平上尝试采用乙偶姻、Na NO₃、糠醛和丙酮对胞内还原力进行调控。发酵结果显示,Na NO₃作为外源电子受体能在一定程度上提高菌株产酸能力。由于氧气也可以作为电子受体,可能影响Na NO₃接受H⁺,因此对比了在不同溶氧条件下添加Na NO₃对菌株产酸的影响。发酵结果表明,无氧条件下当添加Na NO₃后,丙酮酸产量从3.42 g/L提高到了5.67 g/L,糖酸转化率提高到了90%;而在100 r/min转速的微氧条件下,添加200 m M Na NO₃可以大幅提高糖酸转化率,从未添加Na NO₃的对照组的76%提高至95.84%,但是丙酮酸的产量却从7.98 g/L下降到6.23 g/L。（4）在底物水平上调控大肠杆菌胞内还原力。对比了葡萄糖酸钠和葡萄糖作为底物时丙酮酸的产量,发现在以葡萄糖酸钠为底物进行的丙酮酸发酵不仅将丙酮酸产量从32.43 g/L提高至43.52 g/L,糖酸转化率和丙酮酸生产强度分别提高了17.4%和135.45%。在随后的分批补料的5 L发酵罐发酵实验中,丙酮酸总产量提高至62.42 g/L。表明葡萄糖酸钠能够明显地解决还原力不平衡的问题从而提高丙酮酸产量。