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研究背景及目的:宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,近年来有发病年轻化的趋势。人类Kruppel-like factor 14(KLF14),又称 BTEB5,是无内含子基因编码 Kruppel 样转录因子家族的成员之一,其编码的蛋白质起转录共阻遏物的作用,并可被TGF-β因子诱导来抑制TGF-β受体Ⅱ基因表达。现有研究表明KLF14与皮下脂肪内多种基因表达相关,是控制这些基因的总开关。新近研究发现KLF14在多种肿瘤的发生发展中同样发挥着重要作用,但是目前尚未有关于其在宫颈癌增殖、自噬中的研究报道。目的:1.明确转录因子KLF14在宫颈癌细胞增殖、自噬、凋亡中发挥的作用;2.探讨KLF14是否通过自噬对宫颈癌细胞增殖和凋亡产生影响;3.探索与KLF14相关的自噬基因,筛选出KLF14作用于宫颈癌细胞自噬可能的下游靶基因。研究方法:1.构建过表达KLF14的载体质粒,瞬时转染人宫颈癌细胞系HeLa、C-33A细胞,采用RT-PCR、Western blot验证基因水平及蛋白质水平上的表达效果。2.应用克隆形成实验、Cell Counting Kit-8(CCK-8)以及EdU细胞成像系统研究转录因子KLF14在人宫颈癌细胞增殖中发挥的作用。3.采用Western blot技术检测HeLa细胞中自噬体膜标志蛋白LC3、自噬底物p62来探索KLF14对HeLa细胞自噬的影响;采用Western blot、细胞免疫荧光技术探索KLF14对C-33A细胞自噬的影响。4.采用流式细胞术探索转录因子KLF14对宫颈癌细胞凋亡的影响。5.采用自噬抑制剂3-MA预处理KLF14高表达的HeLa、C33A细胞系,通过CCK-8、平板克隆形成实验、流式细胞术探索KLF14是否通过改变细胞自噬的水平从而对宫颈癌细胞增殖、凋亡产生影响。6.上调转录因子KLF14的表达,应用RNA-seq测序实验挑选与KLF14相关的下游基因。7.结合文献与GO功能分析筛选与KLF14相关的下游自噬基因,采用PT-PCR技术在细胞水平验证。结果:1.KLF14抑制宫颈癌细胞增殖KLF14对宫颈癌细胞增殖的影响:宫颈癌细胞系HeLa、C-33A上调KLF14表达后进行CCK-8、平板克隆形成和EdU细胞成像实验,结果表明转录因子KLF14抑制宫颈癌细胞增殖。2.KLF14促进宫颈癌细胞自噬KLF14对宫颈癌细胞自噬的影响:Western blot结果显示,在HeLa细胞中,与对照组相比,过表达组自噬体膜标志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ比值增大、自噬底物p62明显减少,表明KLF14促进HeLa细胞自噬;在C-33A细胞中,Western blot结果显示,过表达组自噬体膜标志蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ 比值增大,细胞免疫荧光结果显示,过表达组LC3含量多于对照组,表明KLF14促进C-33A细胞自噬。3.KLF14抑制宫颈癌细胞凋亡KLF14对宫颈癌细胞凋亡的影响:宫颈癌细胞系HeLa、C-33A上调KLF14表达后进行流式细胞术检测,结果表明转录因子KLF14抑制宫颈癌细胞凋亡。4.KLF14通过自噬抑制细胞凋亡、对细胞增殖无影响在过表达KLF14的基础上,使用3-MA处理细胞后检测细胞增殖和细胞凋亡。结果表明,自噬被抑制后,凋亡细胞率上升;Cell Counting Kit-8(CCK-8)和平板克隆实验结果显示,细胞增殖并没有明显改变。总体而言,结果表明转录因子KLF14通过诱导细胞自噬来抑制凋亡,但对细胞增殖并无明显影响。5.与KLF14相关的下游自噬基因高通量分子测序实验共筛选出与KLF14相关的下游基因862个(与阴性对照组相比,表达水平增加的基因有750个,基因表达水平下降的有112个);通过查阅文献并结合GO功能分析,从中挑选出10个与细胞自噬相关的基因,包括 DEPP1、EVA1A、FOXO3、LAMP3、IRGM、ATP6V1C2、TRIM17、TRIM22、WNT16、MAP1LC3A。RT-PCR验证FOXv3、EVA1A基因水平上的表达,结果证实与测序结果相同。查阅文献,基于TCGA数据库,发现FOXO3在宫颈癌中下调表达,并且FOXO3表达与宫颈癌患者预后成负相关。结论:1.转录因子KLF14在宫颈癌中发挥的作用为抑制增殖、诱导细胞自噬以及抑制凋亡。2.KLF14通过促进自噬抑制宫颈癌细胞凋亡。3.筛选出与KLF14相关的自噬基因10个,包括EVA1A、FOXO3等。意义:本研究验证了转录因子KLF14在宫颈癌细胞增殖、自噬以及凋亡中的作用,丰富、完善了宫颈癌的发生发展机制,为临床诊疗提供理论依据;得出了KLF14在宫颈癌中发挥的重要作用为抑制增殖,分析了其作为宫颈癌靶向药物治疗新靶标的可能性。