【摘 要】
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目的:粪肠球菌导致的脑膜炎已引起了较大的公共卫生安全问题,但关于其穿越血脑屏障的机制尚不清楚,本研究从宿主-病原菌相互作用的角度入手,利用small RNA测序技术,结合多种生物信息学分析手段,筛选、挖掘与血脑屏障通透性改变相关的调节基因和关键通路,以期为揭示粪肠球菌脑膜炎的发生机制研究提供可靠的理论依据。方法:以实验室保存的致羔羊脑膜炎粪肠球菌为试验菌株,清洁级小鼠为试验动物构建粪肠球菌感染小鼠
【基金项目】
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项目名称:致幼畜脑膜炎粪肠球菌穿越血脑屏障的机制初探;国家自然科学基金（No.31360596）项目编号:31760737
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目的:粪肠球菌导致的脑膜炎已引起了较大的公共卫生安全问题,但关于其穿越血脑屏障的机制尚不清楚,本研究从宿主-病原菌相互作用的角度入手,利用small RNA测序技术,结合多种生物信息学分析手段,筛选、挖掘与血脑屏障通透性改变相关的调节基因和关键通路,以期为揭示粪肠球菌脑膜炎的发生机制研究提供可靠的理论依据。方法:以实验室保存的致羔羊脑膜炎粪肠球菌为试验菌株,清洁级小鼠为试验动物构建粪肠球菌感染小鼠的脑损伤模型;通过目标菌株的分离鉴定和病理切片观察以及血清中PCT和CRP的浓度检测来判断小鼠是否出现脑膜炎症状;通过检测脑组织中伊文思蓝不同时间段的变化来观察血脑屏障通透性的改变;选取三个时间段,与对照组小鼠脑组织进行small RNA测序,并进行生物信息学分析;对筛选出与血脑屏障相关的差异miRNA进行靶基因预测及靶向关系验证;初步验证相关miRNA靶基因在血脑屏障中的功能;通过上述试验探究miRNA在粪肠球菌破坏血脑屏障时发挥的作用。结果:试验一、粪肠球菌人工感染小鼠模型的建立研究结果表明,小鼠血清中PCT在24 h和60 h有显著差异（P＜0.05）,在48 h时具有极显著性差异（P＜0.01）,小鼠血清中CRP含量在12 h和60 h具有显著性差异（P＜0.05）,24 h和48 h具有极显著性差异（P＜0.01）,病理切片观察到小鼠脑组织出现损伤;EB检测发现小鼠血脑屏障的通透性发生改变,证明成功构建了粪肠球菌感染小鼠脑损伤模型。试验二、小鼠体内血脑屏障损伤模型脑组织miRNA文库构建研究结果表明,测序数据分析后测序结果质量高,所得数据可靠;成功筛选出差异表达miRNAs;GO和KEGG富集分析表明,差异miRNAs主要与细胞代谢,细胞骨架调节以及细胞的凋亡、炎症等通路相关,并筛选出与血脑屏障相关的miR-34c-5p和miR-21a-5p。试验三、mmu-miR-34c-5p和mmu-miR-21a-5p的靶标关系验证研究结果表明,双荧光素酶试验显示CCL1与mmu-miR-21a-5p存在明显靶向关系,STK38L与mmu-miR-34c-5p不存在明显靶向关系。试验四、CCL1在鼠脑微血管内皮细胞中对MAPK通路关键蛋白磷酸化的影响研究结果表明,CCL1刺激脑微血管内皮细胞后,JNK的磷酸化水平升高,在60 min时具有显著性差异（P＜0.05）,在120 min时具有极显著差异（P＜0.01）;p38的磷酸化水平升高,在30min时具有显著性差异（P＜0.05）,在120 min时具有极显著差异（P＜0.01）。结论:miR-21a-5p在粪肠球菌小鼠模型脑组织中差异表达,并和CCL1有明显靶向关系,CCL1可以刺激脑微血管内皮细胞中JNK和p38蛋白的磷酸化,所以推测miR-21a-5p可能直接或者间接的调控MAPK通路进而影响血脑屏障的通透性。
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