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乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)的感染在中国高发,其持续感染易导致肝硬化和肝癌,严重危害人类健康,所以防治HBV感染成为我国传染病研究的热点。乙肝疫苗对未感染者具有明显保护作用,但是,HBV感染尤其是慢性感染的治疗仍然面临很大的困难。目前,核苷类药物和干扰素被广泛用于抗HBV治疗,但缺乏切实有效的长期应答效应以及个体耐药等因素制约了疗效,亟需寻找新的治疗靶点和药物。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)作为一种重要的病原生物模式识别受体,能够识别HBV等病毒。TLR/IL-1R信号转导通路,在炎症反应和机体天然免疫中起着举足轻重的作用,该通路中的关键信号分子可能成为抗HBV的新靶点。Toll作用蛋白(Toll-interacting protein,Tollip)是TLR/IL-1R信号转导通路中的一个关键接头蛋白,它对HBV的感染有何影响是一个值得探讨的问题。本文通过构建含HA标签蛋白的Tollip真核表达载体pCMV-HA-Tollip,并成功转染人肝癌细胞株HepG2.2.15,通过观察其对HBV抗原的影响,分析TLR/IL-1R信号转导途径中重要分子的表达,以期初步阐明Tollip在抗HBV感染中的作用,为乙肝的治疗提供新的理论依据和治疗靶点。具体内容如下:目的:构建含HA标签的重组表达质粒pCMV-HA-Tollip,转染HepG2.2.15细胞,检测其对HBV抗原分泌的影响并探讨其机制。方法:1.构建真核表达载体pCMV-HA-Tollip双酶切及DNA测序鉴定。2.采用脂质体转染法,将质粒pCMV-HA-Tollip转染HepG2.2.15细胞。3.ELISA法检测HBsAg和HBeAg的表达。4.Western Blot法检测AKT、p-AKT、NF-κB的差异表达。结果:1.成功构建了真核表达载体pCMV-HA-Tollip。2.质粒成功转染HepG2.2.15细胞48h后,3μg空质粒与3μg pCMV-HA-Tollip共转染组、6μg pCMV-HA-Tollip转染组中HepG2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌量明显低于6μg空质粒转染对照组,对HBsAg的抑制率分别为24%和41%(p<0.01),对HBeAg的抑制率分别为13%和31%(p<0.01);与6μg空质粒转染组相比,3μg空质粒与3μg pCMV-HA-Tollip共转染组和6μg pCMV-HA-Tollip转染组中NF-κB、p-AKT的表达明显降低(p<0.01),而AKT的表达没有明显的变化。结论:1.成功构建pCMV-HA-Tollip重组真核表达质粒。2.pCMV-HA-Tollip重组质粒在HepG2.2.15细胞中能有效抑制HBsAg和HBeAg的分泌,其机制可能与抑制AKT的磷酸化和下调NF-κB的表达有关。