目的大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery oclusion,MCAO）法复制大鼠局灶性脑缺血模型，探讨单唾液酸神经节苷脂钠（monosialotetrahexosylganglioside,GM-1）对缺血性脑损伤大鼠的保护作用及机制，并通过H2O2介导的体外人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）损伤模型，从体外实验角度探讨GM-1对血管内皮细胞的保护作用，初步明确磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3kinase,PI3K）/糖原合成酶激酶-3（glycogen synthasekinase3,GSK-3）信号通路在脑缺血性损伤中的作用。方法本研究从体内实验和体外细胞培养2个方面进行探讨，主要方法如下：1.动物实验将大鼠随机分为假手术组（Sham组）、脑缺血组（Model组）及GM-1治疗组3组，每组10只，除Sham组外，其余2组大鼠均采用改良线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉复制局灶性脑缺血模型，GM-1治疗组于造模成功当天腹腔注射GM-110mg/kg体重，每天两次，连续给药7d。Sham组及脑缺血组腹腔注射生理盐水1ml/kg体重，每天两次，连续给药7d。3组大鼠自手术清醒后每日采用改良NSS评分标准（16分制）进行神经功能评分；术后第8天处死大鼠，取脑组织行常规HE染色及免疫组化检测各组大鼠脑组织CD31、PI3K及GSK-3表达，结果用Image J图像分析软件进行半定量分析。2.体外实验将常规培养的HUVEC分为对照组（CTRL组），H2O2处理组及GM-1低、中、高剂量（1、5、10mg/l）处理组，分别用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，用流式细胞术进行细胞周期分析，Bradford法测定样本总蛋白浓度，以免疫荧光法、Western blot法检测各组培养细胞PI3K、Akt及GSK-3蛋白表达情况；并分别检测各组HUVEC细胞浆与细胞核中NF-κb的表达。进一步将HUVEC分为对照组（CTRL组），H2O2处理组，CHIR-99021处理组及LY294002处理组，用Western blot法和Real-time PCR法检测各组培养细胞细胞浆与细胞核中PI3K、Akt及GSK-3蛋白及mRNA含量。结果1. GM-1对MCAO致大鼠脑缺血损伤的保护作用1.1各组大鼠一般状况及神经功能评分比较动物实验结果显示，假手术组大鼠精神状态良好，活动正常，皮毛光泽，术后无神经功能障碍表现，未见任何反射异常；脑缺血组大鼠精神状态较差，活动减少，出现不同程度行为学障碍，随着饲养时间的延长，上述症状有不同程度的恢复；GM-1组大鼠于造模初期，上述症状与脑缺血组相似，随给药时间延长，脑缺血症状改善明显，自给药第4天起，与脑缺血组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。1.2各组大鼠脑组织HE染色结果Sham组大鼠脑组织神经元及胶质细胞数量、形态分布正常，细胞膜完整，胞浆均匀，细胞核位于中央，染色质分布较均匀；脑缺血组大鼠脑组织在光镜下的主要改变是不同程度的神经元变性、坏死和胶质细胞反应。镜下可见缺血灶中心区以神经元变性、坏死为主，缺血灶周围胶质细胞增生活跃，并逐渐向缺血灶中心移动，缺血区胶原成分增加。GM-1治疗组大鼠脑组织神经变性及坏死情况较脑缺血组有不同程度的改善。1.3各组大鼠脑组织CD31免疫组化结果CD31阳性细胞呈棕色或棕黄色。在Sham组大鼠，CD31阳性细胞呈单个散在分布或排列成细条索状排列。与Sham组比较，脑缺血组大鼠缺血区周围CD31表达明显增加，GM-1组阳性信号增加，与脑缺血组比较，差异具有显著性（P<0.01）。2. GM-1对PI3K/GSK-3信号转导通路的影响2.1各组大鼠脑组织PI3K免疫组化结果在Sham组大鼠，PI3K主要在正常神经元细胞浆中表达，胶质细胞及内皮细胞中亦有少量表达；在脑缺血组，脑缺血7d后，缺血灶中PI3K表达量减少，阳性信号主要集中在血管内皮细胞及增生的胶质细胞细胞浆，与Sham组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；GM-1组大鼠缺血灶中胶质细胞增生明显，PI3K仍主要表达于增生的胶质细胞及内皮细胞胞浆中，与脑缺血组比较，差异具有显著性（P<0.01）。2.2各组大鼠脑组织GSK-3免疫组化结果Sham组大鼠脑组织中GSK-3表达量为6.42±0.58%，GSK-3阳性信号主要分布神经元、胶质细胞及内皮细胞细胞浆中；在脑缺血组，脑缺血7d后，缺血灶中GSK-3表达量明显增加，且主要集中在血管内皮细胞及增生的胶质细胞细胞浆中，残存的神经元细胞中亦有表达，与Sham组比较，GSK-3表达量增加，差异有显著性（P<0.05）；GM-1组大鼠缺血灶GSK-3仍主要表达于增生的胶质细胞及内皮细胞胞浆中，与脑缺血组比较，其表达量明显降低，差异具有显著性（P<0.01）。3. H2O2与血管内皮细胞氧化损伤3.1CCK-8检测结果以对照组细胞为100%，H2O2处理组细胞增殖率为75.97%，明显低于对照组（P<0.001）；GM-1中、高剂量细胞增殖能力明显高于H2O2处理组，差异显著（P<0.001，0.05），而与H2O2处理组比较，GM-1低剂量组细胞增殖能力差异不显著。3.2流式细胞术结果对照组50.87%细胞处于G2/M期和S期，与H2O2处理组（13.52%）比较，组间差异显著（P<0.0001）。GM-1低、中、高剂量组处于G2/M期和S期的细胞比例分别为33.95%，30.70%和28.68%，与H2O2处理组比较，差异显著（P<0.001，0.01）。4. PI3K/GSK-3信号转导途径与内皮细胞氧化损伤4.1PI3K及GSK-3Western blot检测结果与对照组比较，H2O2处理组HUVEC PI3K表达量明显降低（P<0.01），与H2O2模型组比较，GM-1中、高剂量组PI3K表达明显增加（P<0.05）；与对照组比较，H2O2处理组细胞GSK-3/β表达明显升高（P<0.01）；在GM-1各处理组，随着GM-1应用浓度降低，GSK-3/β蛋白表达量逐渐升高，与H2O2损伤组比较，GM-1高剂量组GSK-3/β蛋白表达量明显下降，差异有显著性（P<0.05）。与H2O2处理组比较，CHIR-99021组及CHIR-99021+H2O2组PI3K和p-Akt蛋白表达量明显增加（P<0.01），GSK-3表达量则明显降低（P<0.01）；LY294002+H2O2组PI3K和p-GSK-3表达量显著降低（P<0.01）；LY294002组和LY294002+H2O2组p-Akt表达量明显增加（P<0.01）。4.2Real-time PCR结果与对照组比较，H2O2处理组PI3K、Akt mRNA表达明显降低，差异有显著性（P<0.01），而GSK-3mRNA表达量明显升高（P<0.01）。与H2O2组比较，CHIR-99021组及CHIR-99021+H2O2组PI3K、Akt mRNA表达量明显增加（P<0.01），GSK-3表达量则明显降低（P<0.01）；LY294002+H2O2组PI3K和GSK-3表达量显著降低（P<0.01）；LY294002组和LY294002+H2O2组Akt mRNA表达量明显增加（P<0.01）。5. NF-κb与内皮细胞损伤5.1NF-κb Western blot检测结果各组HUVEC细胞胞浆中NF-κb表达量差异无显著性，而各组细胞NF-κb在细胞核中表达量差异有显著性，H2O2处理组NF-κb核/浆比值为12.07±2.96，与对照组比较，差异有显著性（P<0.05）。与H2O2处理组比较，GM-1中、高剂量NF-κb核/浆比明显升高（P<0.01）。5.2免疫荧光双重染色结果NF-κb在体外培养的HUVEC中均有表达，但各组细胞NF-κb表达部位有差异，H2O2处理组NF-κb主要在HUVEC胞浆表达，而在胞核有较低表达。图像分析结果显示，与H2O2处理组比较，GM-1高剂量组NF-κb在细胞核中表达明显增加，差异具有显著性（P<0.05）。结论1．GM-1可有效保护大脑缺血性损伤，血管内皮细胞可能为其实现此作用的一个重要治疗靶点。2．GM-1刺激血管内皮细胞增生的作用可能与其激活PI3K/GSK-3信号转导通路及NF-κb的核转位有关。创新点1．本研究从内皮细胞损伤修复角度探讨GM-1对脑缺血性损伤的保护作用，国内外未见报道。2．GM-1保护脑损伤的机制相关研究较多，但本研究首次探讨其对PI3K/GSK-3信号通路及NF-κb的影响。