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研究目的：4-羟苯基维胺脂(4-HPR; Fenretinide; N-4-hydroxyphenylretinamide)是一个维甲酸衍生物,在多种肿瘤模型中表现出良好的肿瘤预防和治疗作用。研究表明4-HPR主要通过诱导细胞发生凋亡发挥抗肿瘤作用。然而在临床前及临床研究的低氧环境下,肿瘤细胞对4-HPR产生耐药现象,影响了4-HPR的临床应用。低氧是实体肿瘤中普遍具有的特性之一,在多种生理过程(细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭等)中发挥重要作用,可以激活各种信号通路导致肿瘤细胞对放化疗的耐药。文献提示4-HPR在较低浓度下可能会诱发自噬的产生。在不利于细胞生存的代谢压力下,自噬可以通过降解自身的细胞质和细胞器,在细胞内维持稳态平衡以保护细胞免于发生凋亡性死亡,因此我们推测保护性自噬与4-HPR的低氧耐药相关。本课题针对自噬在4-HPR低氧耐药过程中所发挥的作用开展研究工作,并对相关机制加以探索。研究方法：采用磺基罗丹明B(SRB)染色法评价4-HPR体外抑制肿瘤细胞HeLa增殖作用,并分别计算正常氧压(20%02)和低氧(1%02)下ICso值；采用PI单染结合流式细胞术,考察4-HPR正常氧压和低氧下促肿瘤细胞凋亡的能力；应用Western blot检测细胞凋亡及自噬标志性蛋白(PARP、LC3)及低氧诱导因子HIF-1α的表达,并对相关蛋白条带进行光密度分析；采用吖啶橙染色,在倒置荧光显微镜下定性观察酸性囊泡(AVOs)生成,流式细胞术定量分析红色荧光强度；采用瞬时RNA干扰技术,通过沉默自噬相关基因Beclin 1,考察其在4-HPR引起的自噬中的作用；预孵育抗氧化剂NAC,检测活性氧簇(ROS)对自噬的影响；采用RNA干扰技术沉默HIF-1α,建立稳定敲除HIF-1α的细胞株,检测HIF-1α对于4-HPR诱导发生自噬的作用。研究结果：1.低氧下肿瘤细胞对于4-HPR耐药正常氧压下4-HPR作用人宫颈癌Hela细胞的存活率显著低于低氧下存活率,并呈浓度依赖性。正常氧压下,10μM的4-HPR能引起Hela细胞明显的凋亡,凋亡率达到25.80%。低氧环境中细胞在相同浓度4-HPR作用下,凋亡率仅有7.69%。正常氧压下4-HPR对Hela细胞的半数抑制浓度(IC50)为(6.69±1.49)μM,而在低氧下则为(15.69±3.56)μM。2.4-HPR在低氧下主要引起自噬,而在正常氧压下引起凋亡采用Hela细胞和人卵巢癌OVCAR-8细胞,分别检测低氧和正常氧压下4-HPR作用后凋亡和自噬相关蛋白表达,发现低氧下LC3-Ⅱ蛋白表达的增加呈现浓度依赖性,正常氧压下没有明显的LC3-Ⅱ蛋白表达的累积,凋亡标志蛋白PARP有明显切割。4-HPR(10μM)作用人宫颈癌Hela细胞24h,吖啶橙染色后,使用流式细胞仪(Becton Dickinson)进行分析,结果发现,4-HPR(10μM)作用后,红色荧光强度从3.45%升高到19.36%,表明4-HPR低氧下可以诱导自噬发生。而在使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)预孵育后加入4-HPR作用的实验组,红色荧光强度仅为7.02%,表明自噬的发生被抑制。4-HPR(20μM)作用于人卵巢癌OVCAR-8细胞24 h,吖啶橙染色后,在荧光显微镜下观察到酸性囊泡数目的增加,而在使用自噬抑制剂3-MA预孵育后加入4-HPR作用的实验组,酸性囊泡的增加受到了抑制,说明3-MA可以抑制由4-HPR诱导的自噬发生。3.低氧下4-HPR诱导的肿瘤细胞自噬对细胞产生保护作用在Hela细胞上,将自噬抑制剂3-MA和氯喹(CQ)分别与4-HPR联用,结果发现CQ/4-HPR或3-MA/4-HPR合用,PARP的切割较4-HPR单用有明显的增加。应用流式细胞术,检测4-HPR在正常氧压和低氧下引起的细胞凋亡率。4-HPR单用凋亡率为6.64±0.79%,3-MA单用凋亡率为4.00±0.07%,CQ单用凋亡率为4.95±0.60%,而3-MA/4-HPR合用凋亡率为16.06±0.23%,CQ/4-HPR合用凋亡率为21.39±0.32%,显示了自噬的抑制会导致4-HPR介导的HeLa细胞凋亡率的增加。正常氧压下3-MA和CQ不能增加4-HPR诱导凋亡的能力,进一步确证正常氧压下4-HPR主要引起凋亡而非自噬。应用SRB检测低氧下自噬被抑制后4-HPR的细胞存活率的变化,发现低氧下,3-MA显著地增强了4-HPR对细胞的增殖抑制作用,10μM 4-HPR单用24 h的HeLa细胞增殖抑制率为41.24±5.61%,2 mM 3-MA与10μM 4-HPR合用的细胞增殖抑制率为55.97±4.67%p<0.05)。4. Beclin 1蛋白参与了4-HPR诱导的自噬Beclin 1蛋白是自噬体形成过程中所必需的促自噬基因的产物,参与了自噬的起始阶段,在HeLa细胞中沉默Beclin 1基因显著地抑制了低氧4-HPR诱导的自噬。这个结果显示,低氧下4-HPR诱导自噬的发生需要Beclin 1蛋白的参与。在HeLa细胞中外源性转入Beclin 1导致Beclin 1蛋白水平的提高时,4-HPR在正常氧压条件下也能明显诱导自噬发生,进一步说明Beclin 1蛋白参与了4-HPR诱导的自噬。5.低氧下4-HPR诱导自噬不依赖于活性氧簇正常氧压下活性氧簇(ROS)清除剂NAC能显著减少4-HPR引起的PARP切割,说明4-HPR诱导的凋亡被NAC成功逆转,提示正常氧压下4-HPR凋亡诱导作用的发挥依赖于ROS。低氧下NAC并不能抑制LC3-II蛋白表达的累积,说明低氧下4-HPR诱导自噬是不依赖于ROS的。6.HIF-1α介导了低氧下4-HPR诱发的自噬与Hela细胞相比,稳定敲除HIF-1α基因的Hela细胞对4-HPR(24 h)的敏感性明显增加,4-HPR(10μM)作用下,Hela细胞的存活率为58.76±5.61%,稳定敲除HIF-1α基因的Hela细胞存活率为27.26±6.61%(p<0.01)。在稳定敲除HIF-1α基因的Hela细胞中,4-HPR(10μM)能导致明显的PARP切割片段的产生,却不能诱导自噬的产生,说明HIF-1α蛋白的表达对于4-HPR诱发的自噬是必要的。结论：本论文较为系统的研究了在低氧情况下,4-HPR作用于人宫颈癌Hela细胞和人卵巢癌OVCAR-8细胞过程中自噬发挥的作用,并对相关机制加以探索。研究发现,4-HPR可以诱导保护性自噬发生,这种保护性自噬由HIF-1α介导,依赖于Beclin 1的存在,但不通过活性氧簇(ROS)介导。稳定敲除HIF-1α造成的自噬下降和凋亡上升的现象,提示我们将4-HPR应用于临床治疗的过程中,对HIF-1α的调控很有可能成为逆转4-HPR低氧耐药乃至其他化疗药物的低氧耐药的有效手段之一