论文部分内容阅读
胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，是肿瘤死亡的第三大常见原因。虽然胃癌的发病率与死亡率一直是逐年降低的，但其仍然是世界范围内一个重要的公共卫生问题。前期研究证实SIRT1在胃癌中的表达是下调的，它通过抑制细胞周期蛋白cyclinD1诱导G1期停滞，从而抑制胃癌的发生发展。然而，引起SIRT1下调潜在的上游调控机制仍然未知。 目的: 探究miR-543通过调控SIRT1的表达促进胃癌发生发展的分子机制，为胃癌的治疗提供新的靶点。 结果: 1.利用三种不同的生物信息学软件TargetScan、PicTar和miRanda，初步筛选出了8种可能靶向调控SIRT1的候选miRNAs，分别是miR-92a-3p、miR-128、miR-132-3p、miR-135、miR-138、miR-181、miR-199a-5p和miR-543,其中miR-543与SIRT1 mRNA3-UTR区有两个不同的结合位点，在胃癌细胞系BGC-823中转染候选miRNAs的mimics通过Western blotting实验方法发现miR-543可以使BGC-823细胞中SIRT1的蛋白表达水平显著降低，其他的几个miRNA对SIRT1的表达均无明显影响。 2.在分子水平上，候选miRNA的mimics和inhibitor分别转染人胃粘膜上皮永生细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS、BGC-823,通过qRT-PCR、Western blotting和双荧光素酶活性实验方法分别证实候选miRNA对SIRT1的表达调控作用。结果发现:在BGC-823和GES-1细胞中miR-543使SIRT1的mRNA和蛋白表达水平均明显下调，而在AGS细胞中虽然miR-543使SIRT1的mRNA表达水平没有明显变化，但是SIRT1的蛋白表达水平也是明显下调的。在BGC-823细胞中分别共同转染miR-543 mimics/inhibitor和SIRT1 mRNA3,-UTR野生型载体WT、SIRT1 mRNA3-UTR突变载体Mut-1（第一个位点发生突变）、SIRT1 mRNA3-UTR突变载体Mut-2（第二个位点发生突变）、SIRT1 mRNA3-UTR突变载体Mut-bo(两个位点同时发生突变)，结果发现:转染miR-543 mimics后，SIRT1 WT质粒使细胞荧光素酶活性降低， SIRT1Mut-1质粒、SIRT1 Mut-2质粒使细胞的荧光素酶活性都有一定程度的恢复，而SIRT1 Mut-bo质粒使细胞的荧光素酶活性得到完全恢复。相反，转染miR-543 inhibitor后，SIRT1 WT质粒使细胞荧光素酶活性增加，SIRT1Mut-1质粒、SIRT1 Mut-2质粒使细胞的荧光素酶活性都有一定程度的恢复，而SIRT1Mut-bo质粒使细胞的荧光素酶活性得到完全恢复。 3.在细胞水平上，通过MTS实验方法检测候选miRNA对细胞增殖能力的影响。MTS实验表明，在人胃粘膜上皮永生细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS、BGC-823中转染miR-543的mimics后，AGS，BGC-823和GES-1细胞的增殖能力明显增加。相反，转入miR-543的inhibitor后，AGS、BGC-823和GES-1细胞的增殖能力受到显著抑制。在BGC-823细胞中共同转染miR-543mimics和SIRT1表达载体，SIRT1的表达逆转了miR-543促进细胞增殖的能力。 4.在细胞水平上，通过克隆形成实验检测候选miRNA对细胞克隆形成能力的影响。克隆形成实验表明，在人胃粘膜上皮永生细胞系GES-1和胃癌细胞系AGS、BGC-823中转染miR-543的mimics后，AGS，BGC-823和GES-1细胞的克隆形成能力明显增加。相反，转入miR-543的inhibitor后，AGS、BGC-823和GES-1细胞的克隆形成能力受到显著抑制。在BGC-823细胞中共同转染miR-543 mimics和SIRT1表达载体，SIRT1的表达逆转了miR-543促进细胞的克隆形成能力。 5.在细胞水平上，用流式细胞术分别检测候选miRNA对细胞周期进程的影响，并通过Western blotting检测SIRT1下游分子细胞周期蛋白的表达情况。结果发现:在人胃癌细胞AGS和BGC-823中转染miR-543的mimics后，细胞更多的进入到了G2期，并且使细胞周期蛋白cyclinD1的表达明显增加。相反，转染miR-543的inhibitor后更多的细胞停滞在了G1期，细胞周期蛋白cyclinD1的表达也受到显著抑制。在BGC-823细胞中共同转染miR-543mimics和SIRT1表达载体后，SIRT1的表达逆转了miR-543促进细胞周期进程的作用，并且恢复了细胞周期蛋白cyclinD1的表达。 6.在组织水平上，我们通过qRT-PCR方法检测在胃癌组织及癌旁组织标本中候选miRNA与SIRT1的表达水平，并分析候选miRNA与SIRT1表达水平的相关性，以及候选miRNA表达与病人临床病理学特征之间的关系。结果表明:与正常癌旁组织相比，胃癌中miR-543是高表达的、SIRT1是低表达的，而且miR-543的表达与SIRT1的表达呈现显著的负相关关系。对患者临床病理特征进一步分析发现:miR-543的表达与患者的肿瘤大小、临床分期、TNM分期和淋巴转移显著相关，与患者的性别、年龄和肿瘤浸润无关。 结论: 1.miR-543通过与SIRT1 mRNA3-UTR区两个不同位点相结合靶向下调SIRT1的表达。 2.miR-543通过下调SIRT1的表达促进细胞增殖、克隆形成和细胞周期进展。 3.miR-543在胃癌组织中高表达，与SIRT1的表达有明显的负相关关系，miR-543的表达和胃癌患者肿瘤大小、临床分期、TNM分期和淋巴转移显著相关。