肾脏疾病是儿童时期的常见病之一,现代生物学研究表明肾脏损伤后的修复过程类似胚胎期后肾发育过程的重演,因此,从发育生物学角度研究胚胎肾脏形成机制、肾小球发生和成熟的调控将为揭示肾脏发育不良和肾脏疾病的病理过程提供良好的前景,近年来备受广大肾脏病学者的关注。本课题小组自2003年起开展肾脏发育相关基因的筛选工作,采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization ,SSH)技术构建了新生大鼠肾和生后21天大鼠肾脏组织发育差减文库,通过生物信息学分析,在新生鼠肾文库中,发现了与胚胎发育相关的pea3(polyomavirus enhancer activator3)基因。pea3基因属于Ets癌基因家族成员,目前认为Ets家族蛋白在不同的生物体内可调控生长、转录、T细胞活化和器官发育等。pea3主要表达于鼠类多个发育中的器官,尤其是那些需经历上皮-基质相互作用的组织,如肺脏及乳腺,表明其在这些器官的形成中起重要作用。目前pea3在肾脏发育中的作用及机制,国内外尚未见报导。研究显示,pea3与wnt及wt1(肾脏发育中的两个关键蛋白)关系密切。本研究首先观察了pea3在大鼠肾脏不同发育阶段的时空表达规律;分别予wnt3a诱导、转染pea3真核表达载体、转染pea3 siRNA等方法在整体和细胞水平,进一步探讨该基因表达改变对胚胎肾脏发育的影响,及其与wnt、wt1之间的关系;最后应用斑马鱼为模型,显微注射pea3 mRNA及morpholino,在体观察pea3对肾脏发育的作用及机制。对该基因的研究有助于了解先天性肾脏发育不良和后天性肾脏疾病的病理机制,为基因治疗提供新的靶标。第一部分:pea3基因在大鼠肾脏发育中的时空表达规律目的观察pea3在大鼠肾脏发育中的时空表达规律。方法选择E13(embryo day 13,胚胎第13天)、E15、E17、E19胚胎鼠肾脏和P0(postnatal day 0,生后0天,即新生鼠)、P7、P14、P21及成年鼠肾。分别提取不同时期肾组织总RNA及总蛋白,用于Real-time PCR及western blot,并以不同时期的肾组织进行原位杂交,观察不同时期pea3在大鼠肾脏发育中的时空表达规律。结果Real-time PCR及western blot结果显示:pea3在E13表达很低,从E15至P0显著高表达,至P7表达又显著下调,后逐渐减少,成年大鼠肾脏中几乎不表达;原位杂交结果显示:E15,pea3弥漫表达于输尿管芽分枝及间充质;E17,集中于输尿管芽分枝、其周围间充质及髓质区;E19,主要局限于输尿管芽分枝的顶端,髓质区表达下降;P0,则局限于皮质生肾区,髓质仍可见弱阳性;P7,表达明显下降,只在外皮质的间质区有弱表达;在P14、P21和成年未见明显表达。结论随着大鼠肾脏组织的不断成熟,pea3基因表达逐渐下调,提示该基因可能参与肾脏的发生发育,其在输尿管芽-后肾间充质相互作用时期(E15~P0)呈高表达,且主要表达在输尿管芽分枝端和浓缩的后肾间充质,提示该基因可能参与肾脏发育中上皮-基质之间相互诱导的发育过程。第二部分: pea3基因在大鼠肾脏发育中的作用及机制目的本研究旨在前期研究基础上探讨pea3基因在肾脏发育中的作用及可能的机制。方法(1)应用Real-time PCR技术检测pea3基因在新生大鼠不同组织中的表达;(2)应用双标免疫荧光技术观察pea3基因和wt1基因在大鼠肾脏不同发育时期的表达;(3)人重组wnt3a诱导RIMM-18细胞(大鼠胚胎肾脏间充质细胞株)0~2天,在不同时间点分别做以下观察:a.形态学观察;b.应用Real-time PCR及western blot技术检测pea3、wt1、E-cadherin及vimentin基因的表达;(4)构建pcDNA3.1/ETV4(pea3的人同源基因)真核表达载体,转染RIMM-18细胞0~2天,以wnt3a诱导RIMM-18细胞为阳性对照,空载为阴性对照,分别做以下检测:a.应用western blot技术检测转染效率;b. 0.3%台盼蓝染色观察转染后细胞活力;c.形态学观察;d.应用western blot技术检测wt1、E-cadherin及vimentin基因的表达;(5)设计构建pea3基因的siRNA干扰序列,转染RIMM-18细胞,分别在24小时、48小时做核酸及蛋白水平检测,观察以下内容:a.应用Real-time PCR验证干扰效率及干扰后wt1基因的表达;b. western blot检测pea3、β-catenin、wt1、E-cadherin及vimentin基因的表达;(6)为进一步探讨wnt3a调节pea3的信号通路,分别用人重组wnt3a诱导RIMM-18细胞,或分别予ERK特异性抑制剂U0126及wnt/β-catenin特异性抑制剂DKK-1预处理,western blot技术检测β-catenin、p-ERK、pea3及wt1基因的表达。结果(1)Real-time PCR观察多组织表达情况显示:pea3基因在肾、肺、脑、胰腺等在发育过程中需经历基质-上皮间相互诱导转化的组织中高表达;(2)双标免疫荧光染色发现:在E15、E17,pea3、wt1均表达于密集的后肾间充质细胞,从E19到P7,pea3和wt1都表达于输尿管芽及其分枝的上皮细胞,P14后pea3未再有阳性信号,而wt1局限于成熟的足细胞,验证了先前原位杂交的结果,并可初步提示在肾脏发育过程中pea3和wt1关系密切;(3)wnt3a诱导RIMM-18细胞2天后,细胞可见上皮化改变,Real-time PCR及western blot显示wnt3a诱导后,pea3、wt1及E-cadherin上调,vimentin下调,诱导间充质细胞向上皮细胞转分化(Mesenchymal epithelial Transition, MET)过程;(4)pea3真核表达载体转染RIMM-18细胞2天,western blot显示1:3转染效率最高,台盼蓝染色显示转染后细胞活力达95%以上,倒置显微镜观察转染2天后细胞发生上皮化改变,western blot显示转染后2天,wt1、E-cadherin上调,vimentin下调,诱导MET;(5)Real-time PCR显示代号为885的siRNA干扰效率近50%,pea3下降可致wt1表达下降,β-catenin无明显变化,vimentin稍上调,E-cadherin下调,MET过程受抑制;(6)wnt3a诱导RIMM-18细胞后3~6小时,p-ERK活化,应用U0126后,pea3、wt1表达下降;而应用DKK-1后,pea3、wt1无显著改变。结论(1)已知wt1在胚胎肾发育中起关键作用,而pea3则可通过wt1在肾脏发育间质-上皮转化过程中发挥重要作用;(2)在肾发育间质-上皮转分化过程中,wnt3a可通过ERK途径上调pea3,并进一步上调wt1,但不能排除也存在其他的交叉信号途径共同调节肾发育中的间质-上皮间的转分化过程。第三部分: pea3基因在斑马鱼前肾发育中作用及机制的探讨目的在体观察pea3基因在斑马鱼前肾不同发育阶段的时空表达,并探讨其在斑马鱼前肾发育中的作用及机制,进一步验证先前研究结果,从而为肾脏的发育及某些肾脏疾病的发生机制提供新的理论依据及治疗靶标。方法(1)选择25hpf(hours post fertilization,受精后25小时)、36hpf、51hpf,双色原位杂交技术检测pea3、wt1a在斑马鱼前肾不同发育时期中的表达,RT-PCR方法检测pea3在成年斑马鱼中肾组织中的表达;(2)予显微注射pea3 mRNA及对照mRNA,原位杂交分别检测24hpf、48hpf时,斑马鱼前肾标记基因wt1a、podocin、pax2.1、cdh17的表达;(3)予显微注射吗啡啉RNA(morpholino, MO)的方法抑制pea3及erm的表达,原位杂交观察wt1a及cdh17在24hpf及48hpf时的表达,Real-time PCR检测wt1a、podocin在显微注射后7dpf斑马鱼中的表达,随后分三组:分别注射对照、pea3/erm morpholino及pea3/erm morpholino + pea3 mRNA,原位杂交观察上述标记基因的表达;(4)分四组:分别注射对照、wt1a mRNA、pea3/erm morpholino及pea3/erm morpholino + wt1a mRNA,原位杂交观察48hpf时podocin、cdh17的表达。结果(1)双色原位杂交观察斑马鱼前肾不同发育时期pea3、wt1a的表达:25hpf,wt1a大量表达于前肾小球原基,pea3未见表达;36hpf,pea3、wt1a均表达于前肾小球原基,wt1a较pea3丰富;51hpf,二者均表达于前肾小球,pea3表达较前增加;RT-PCR显示斑马鱼中肾亦见pea3表达;(2)显微注射pea3 mRNA,原位杂交观察:斑马鱼前肾发育延迟,wt1a、podocin分布不规则,未能在中线正常融合,pax2.1、cdh17表达无显著异常;(3)反向应用morpholino降低目的基因表达部分,同时注射pea3/erm morpholino,可致部分胚胎发生心包水肿,原位杂交观察:wt1a、podocin的表达面积显著减少;两肾小球间距离异常增宽,未能正常融合;cdh17和pax2.1表达亦无明显改变,仅单独注射pea3或erm morpholino时,前肾小球发育无显著影响;同时注射pea3 mRNA及pea3/erm morpholino,原位杂交显示wt1a、podocin的表达恢复至与对照组类似;(4)同时注射pea3/erm morpholino及wt1 mRNA,原位杂交观察podocin的表达亦可恢复。结论(1)pea3表达于斑马鱼前肾;(2)pea3及erm可能通过调控wt1a的表达在斑马鱼前肾发育中起重要作用,从而进一步验证了前期在大鼠中的研究结果。