目的(1)在前期构建pExpress-1-rHSG重组质粒载体基础上,构建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)pAdtrack-cmv-rHSG重组穿梭质粒并鉴定,为进一步构建腺病毒载体及脑血管痉挛的基因治疗提供物质基础;(2)对测序报告结果中rHSG基因序列进行序列与结构相关的生物信息分析,为认识该基因结构与功能提供借鉴。方法(1)目的基因的提取:复苏本室保存的含pExpress-1-rHSG质粒的Jm109菌,用质粒抽取试剂盒抽取质粒pExpress-1-rHSG,并在PCR仪中扩增出目的基因rHSG cDNA。(2)穿梭质粒的构建及鉴定:①复苏本室保存的含腺病毒穿梭质粒pAdtrack-cmv的DH5α菌种,用质粒抽取试剂盒抽取质粒pAdtrack-cmv;②将PCR后rHSG cDNA连接到pGM-T质粒上,构建重组质粒pGM-T-rHSG,并对重组质粒进行限制性内切酶酶切鉴定;③将pGM-T-rHSG重组质粒在LB固体琼脂培养基上转化到大肠杆菌DH5α,提取pGM-T-rHSG质粒;④用BglⅡ、Eco RV对pGM-T-rHSG重组质粒进行双酶切,提取目的基因并鉴定;⑤用BglⅡ和Eco RV双酶切pAdtrack-cmv质粒得到线性化的pAdTrack-CMV片断,在T4DNA连接酶下与目的基因连接,构建出重组pAdtrack-cmv-rHSG穿梭质粒,并对重组穿梭质粒pAdtrack-cmv-rHSG进行酶切鉴定;⑥将重组穿梭质粒送测序公司进行DNA序列分析。(3)rHSG基因生物信息分析:根据测序报告结果中rHSG基因序列,用生物信息学方法对其进行同源性、分子量、蛋白跨膜区、等电点、亲疏水性、蛋白二级结构等项的分析和预测。结果(1)从质粒pExpress-1-rHSG中成功提取出了rHSG cDNA基因。(2)重组pAdtrack-cmv- rHSG穿梭质粒经BglⅡ和Eco RV双酶切后,进一步将重组体进行基因测序分析,验证了克隆的rHSG cDNA序列与GenBank[AF036536]公布的rHSG序列吻合。这一结果表明重组体pAdtrack-cmv-rHSG中插入的目的基因是正向、单倍插入。(3)rHSG生物信息分析结果显示,rHSG全长4151bp,编码一757氨基酸残基的蛋白,可能为一跨膜蛋白,经基因Genebank查询发现与人HSG基因序列有95.2%同源性。结论(1)成功构建了大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)真核表达载体pAdtrack-cmv- rHSG,为深入研究rHSG功能和rHSG基因治疗脑血管痉挛奠定了物质基础;(2)分析rHSG基因序列及蛋白结构,有助于进一步研究该基因的分子和生物学功能。