单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)是一种常见的人类疱疹病原体,包括单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)和单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)。继2003年中国批准世界首个溶瘤病毒“今又生”后,溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)T-VEC(Talimogene laherparepvec)在2015年被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗临床晚期黑色素瘤。了解HSV的生物学过程,是开发基于HSV的溶瘤病毒的基础。HSV感染人体后可潜伏在神经元数年或数十年,在应激状态下又可被激活。LAT潜伏相关转录本(Latency-assistant transcript,LAT)基因是调控HSV病毒潜伏和激活复发的关键。然而,LAT基因转录调控序列和转录调控因子报道很少。本研究拟分析LAT转录调控序列和转录调控因子,构建删除LAT的oHSV,并探索oHSV在胃癌细胞中的杀瘤作用,为开发新型溶瘤病毒抗癌药物提供实验依据。目的:发现单纯疱疹病毒LAT基因转录调控序列和因子,构建删除LAT的oHSV,为溶瘤Ⅰ型单纯疱疹病毒运用于胃癌的溶瘤病毒治疗提供实验基础。方法:1.序列比对确定新毒株HSV-1-LXMW的LAT基因转录调控序列;2.生物信息学分析LAT基因转录调控序列;3.设计用于CRISPR/Cas9基因改造的LAT guild RNA序列;4.构建并鉴定重组质粒。结果:本研究确定了新毒株HSV-1-LXMW的LAT基因转录调控区的序列,通过系统发育进化分析发现HSV-1-LXMW与英国的HSV-1-17株亲缘性具有99%相似。采用权重矩阵的程序匹配软件,本文发现6株HSV 10个LAT转录调控序列与 9 个转录因子:AP-1、C-REL、Comp1、E2F、Hairy、HFH-3、Kr、TCF11/MAFG和v-Myb。并且文献分析发现转录因子v-Myb和AP-1具有调控LAT转录的功能,尤其是AP-1转录因子有调节HSV潜伏感染和维持潜伏感染的功能。最重要的是,预测了其他7个新的HSV LATs转录因子及其相应的转录调控序列,通过多序列对比分析的进一步验证表明,HSV的LAT基因转录调控序列含1 1个保守区。在HSV-1 或 HSV-2 株中,LAT 转录调控序列的 Hairy、HFH-3、v-Myb、Comp1、c-REL和TCF11/MAfG结合位点是保守的,从而支持LAT转录调控序列可能具有生物学功能,同时实验数据表明HSV-1和HSV-2没有共同的转录调控序列。这些发现增加了对HSV生物学和溶瘤病毒治疗中转录调控的理解。针对HSV-1-LXMW的LAT序列分析,设计了 LAT序列的gRNA,并成功克隆到PX458-LAT质粒中,为后续构建重组oHSV及治疗胃癌奠定了基础。结论:1.确定了本研究室新分离的中国毒株HSV-1-LXMW的LAT基因转录调控区序列,发现其与英国的HSV-1-17同源性高达99%。2.通过分析包括HSV-1-LXMW的6株HSV的序列,首次发现HSV的LAT基因的10个转录调控序列和9个LAT转录调控因子(AP-1、C-REL、Comp1、E2F、Hairy、HFH-3、Kr、TCF11/MAFG 和 v-Myb)。其中,转录调控因子 v-Myb 和AP-1在HSV文献中得到验证,证实了其调节HSV潜伏感染和维持潜伏感染的机制。其它7个是新发现的HSV LAT转录调控因子。该发现对HSV生物学及肿瘤的溶瘤病毒治疗有重要意义。3.确定了本研究室新分离的中国毒株HSV-1-LXMW的LAT基因序列,设计了独特的删除LAT的溶瘤HSV,构建了用CRISPR/Cas9技术敲除LAT基因的gRNA质粒,为后续完成oHSV-deltaLAT的构建及其对胃癌的治疗作用奠定了基础。