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草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）中国分离物侵染性克隆pSVBV-SY可以侵染森林草莓，但是叶片划伤接种侵染率较低，阻碍了侵染性克隆的研究。为了改进接种方法，本研究利用农杆菌真空抽滤法接种草莓，可显著提高接种效率，pSVBV-SY在森林草莓上实现高效侵染且表现出典型镶脉症状。SVBV病毒载体pSVBV-MCS同法接种森林草莓，可验证其侵染性。已有研究发现花椰菜花叶病毒科病毒P6蛋白能够反式激活多顺反子mRNA的翻译，本研究鉴定SVBV P6蛋白是病毒的翻译反式激活因子(transactivator)，能够高效激活人工构建双顺反子第2个基因的表达。预测反式激活因子P6功能域，构建系列P6突变体，发现P6各突变体均不能反式激活双顺反子第2个基因的表达。 1、SVBV侵染性克隆的侵染性鉴定和检测 比较划伤接种法和真空抽滤法接种草莓的接种效率，SVBV沈阳分离物侵染性克隆pSVBV-SY接种森林草莓，均接种15株，35d后检测侵染率，划伤接种侵染率仅在20％-40％之间，真空抽滤法接种侵染率在86％-100％之间。显症植株PCR均能够检测到pSVBV-SY基因组ORFⅣ和ORFⅥ基因。Southern blot（DNA杂交）检测显症森林草莓DNA，进一步验证侵染性克隆pSVBV-SY侵染性，能够检测到病毒基因组DNA。结果表明，侵染性克隆pSVBV-SY具有侵染性，且能够在森林草莓上出现典型镶脉症状，真空抽滤法接种草莓可以显著提高病毒侵染性克隆接种效率。 2、SVBV病毒载体的侵染性鉴定 SVBV美国分离物病毒载体pSVBV-MCS真空抽滤法接种森林草莓，接种后55d，森林草莓系统幼叶表现出典型的镶脉症状。PCR检测发现，pSVBV-MCS成功侵染森林草莓。与SVBV美国分离物侵染性克隆pSVBV-US相比，接种pSVBV-MCS病毒载体，侵染率降低，寄主显症时间延缓，镶脉症状表型减轻。 3、SVBV侵染性克隆能够反式激活双顺反子表达 克隆CaMV、SVBV-US和SVBV-SY完整ORFⅦ基因和ORFⅠ基因5端51nts片段，分别插入载体pCAM-GFP，构建含有双顺反子的表达载体p35S-Ca71GFP、pUSFlt-US71GFP和pSYFlt-SY71GFP，第1个顺反子是完整ORFⅦ基因，第2个顺反子是ORFⅠ基因5端51nts与绿色荧光蛋白报告基因（gfp）形成的融合基因。SVBV美国分离物侵染性克隆pSVBV-US和pCAM-2b与双顺反子p35S-Ca71GFP共浸润本氏烟，结果表明病毒侵染性克隆能够反式激活双顺反子表达。 4、SVBV病毒反式激活因子的鉴定 为了鉴定SVBV反式激活作用的功能蛋白，构建含有SVBV美国分离物6个ORF的表达载体，pCAM-USP1、pCAM-USP2、pCAM-USP3、pCAM-USP4、pCAM-USP5和pCAM-USP6，分别与双顺反子p35S-Ca71GFP共浸润本氏烟，只有pCAM-USP6能够反式激活双顺反子表达，其余ORF均不具有反式激活功能。实验表明P6蛋白即为SVBV的反式激活因子，协助病毒mRNA的翻译。 pCAM-USP6分别与p35S-Ca71GFP、pUSFlt-US71GFP和pSYFlt-SY71GFP3种双顺反子共浸润本氏烟，发现pCAM-USP6能够反式激活3种双顺反子表达。同理，利用SVBV沈阳分离物pCAM-SYP6与3种双顺反子共浸润本氏烟得到了同样的结果，pCAM-SYP6也能够反式激活3种双顺反子表达。进一步证明P6蛋白的反式激活功能，SVBV不同分离物P6蛋白均可以反式激活双顺反子表达。 5、P6蛋白反式激活核心功能域的探究 为了探究P6蛋白反式激活核心功能域，根据P6蛋白的三维结构以及P6的核定位信号预测其功能域，构建P6的系列突变体pCAM-P6(1-300)、pCAM-P6(301-515)、pCAM-P6(1-113)、pCAM-P6(114-429)、pCAM-P6(430-515)、pCAM-P6(A193-223)和pCAM-P6(△402-426)。P6各个突变体分别与双顺反子pUSFlt-US71GFP共浸润本氏烟，利用激光共聚焦实验观察微观荧光表达情况。结果表明，P6各个突变体反式激活双顺反子表达荧光极为微弱，均不能有效反式激活双顺反子表达。