番茄黄化曲叶病毒的分子鉴定、遗传多样性分析及其诱导抗性相关基因的分离

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:JasonCrazy
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番茄(Solanum lycopersicum Mill.)由于其营养丰富,口味独特,已成为世界性的蔬菜作物之一。随着番茄栽培面积的增加,诸多不利因素(如生物胁迫和非生物胁迫)制约了番茄产业的发展。其中番茄黄化曲叶病毒病(Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, TYLCD)是番茄生产上最严重的病害之一。为了更有效地分析其致病机理,本研究克隆浙江省番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLC V)分离物的全长序列,分析其结构特征,序列同源性及系统发育关系;为了进一步分析其遗传多样性,我们从NCBI网站上检索TYLCV,分析来源于29个国家48个地区TYLCV的基因结构、GC含量、保守性比对及其遗传变异;此外,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测抗感番茄接种前后病毒含量的差异,讨论与其抗性程度的相关性;最后,利用cDNA-AFLP技术分离了TYLCV诱导抗病相关基因。研究结果如下:1. TYLCV的分子鉴定及序列分析运用PCR技术克隆并鉴定了浙江省杭州地区TYLCV分离物,病毒基因全长为2781个核苷酸,共编码6个开放阅读框(AV1、AV2、AC3、AC2、AC1、AC4),即为TYLCV的典型结构;核苷酸序列比对分析发现该病毒分离物与美国的TYLCV同源性最高(99.6%);6个编码区分析显示除云南外,AV2与国内其他地区同源性均高达100%;系统发育关系分析表明病毒分离物与江苏、北京、美国、墨西哥的TYLCV划分为一类,亲缘关系最近。2. TYLCV的遗传多样性分析NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上共检索到48个TYLCV; GC含量分析表明没有较大差异,随着核苷酸长度的变化趋势较一致;序列比对表明这些TYLCV的保守性很高;系统发育关系分析这些TYLCV被分为10类;同源性分析显示,序列间差异较大,序列间同源性最低为72.8%,最高为98.6%。3. TYLCV的定量分析利用qRT-PCR技术对抗、感番茄材料在接种后不同时期病毒含量进行分析,结果表明:接种后同一时期抗病材料的病毒含量总体低于感病材料;除TY-1+2+3+5番茄材料,其它抗病番茄材料的病毒含量随着时间的增长均呈现先升高后降低的趋势;番茄材料的病毒含量与抗性呈现一致性。4.运用cDNA-AFLP技术分离番茄抗TYLCV的差异表达基因利用cDNA-AFLP技术分离抗病番茄在接种后不同时期的差异表达基因,结果表明:共筛选出287条转录差异片段,其中156条上调表达,131条下调表达;对其中15个转录表达片段(Transcript-derived fragment, TDF)进行序列分析,11个TDF与NCBI已有序列同源,功能涉及代谢、信号传导、转录调控、DNA结合以及逆境诱导蛋白,另有4个TDF无同源序列或同源性低,预测是一些未知功能基因。总之,这些结果一方面为今后揭示TYLCV的致病机理及番茄黄化曲叶病毒病的诊断和防治提供科学依据;另一方面为番茄与TYLCV的互作、番茄抗TYLCVD相关基因功能研究奠定基础。
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