论文部分内容阅读
目的自身免疫性肝炎(AIH)发病机制尚不明确。AIH患者及相关免疫缺陷小鼠模型存在肠道菌群失衡,但肠道菌群失衡与AIH发病的因果关系尚不明确。本文拟讨论万古霉素引起的肠道菌群失衡对刀豆蛋白A(Con A)诱导的急性免疫性肝损伤的影响及可能的机制,进而比较AIH患者与健康人的肠道菌群差异,通过菌群移植(FMT)将人粪便上清灌胃给小鼠,最后分析不同来源的肠道菌群对小鼠肝脏的影响及潜在机制。方法第一部分:万古霉素诱导的肠道菌群失衡加重小鼠免疫性肝损伤无特定病原体(SPF)级别雌性C57BL/6小鼠(8周龄),随机分为正常对照(Control)组、万古霉素(VANC)组、Con A造模(Con A)组和Con A联合万古霉素造模(Con A+VANC)组。VANC处理的两组给予0.5mg/ml盐酸万古霉素水自由饮水2周,非VANC处理组自由饮用无菌水2周。所有Con A干预组在小鼠处死前12h予Con A(13mg/kg)尾静脉注射,其余组注射磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为对照,处死前4小时给予异硫氰酸荧光素-右旋糖酐(FITC-dextran)灌胃,处死小鼠后取材检测各组血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平评价肝功能,苏木精-伊红染色法(HE)评价肝组织炎症及坏死程度,分光光度计检测血浆FITC-dextran浓度,评价肠道通透性。气相色谱法用以检测盲肠内容物短链脂肪酸水平。实时荧光定量PCR检测肝组织中IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α基因表达水平,蛋白质印迹法检测肝组织中SQSTM1/p62、LC3B-I、LC3BII等自噬相关蛋白的表达量。第二部分:AIH患者肠道微生物可引起小鼠肠道通透性增加和菌群移位收集2019年7月-2019年10月之间就诊于天津医科大学总医院消化科门诊的AIH患者5例,同期收集年龄、性别相匹配的健康志愿者5例,无菌容器分别收集每位参与者粪便,在相对无菌环境下分别混合AIH、健康对照者粪便,提取粪便上清。SPF级别雌性C57BL/6小鼠(6周龄)在实验前均接受四种抗生素混合饮用水肠道菌群消融预处理,随机进行如下分组和相应处理:(1)AIH组(AIH,n=8):AIH患者粪便上清灌胃;(2)健康对照组(Healthy,n=8):健康人粪便上清灌胃;(3)空白对照组(Control,n=6):无菌水灌胃;(4)AIH+DSS组(n=8):AIH患者粪便上清灌胃,间断给予DSS饮用水;(5)Healthy+DSS组(n=8):健康人粪便上清灌胃,间断给予DSS饮用水;(6)Control+DSS组(n=6):无菌水灌胃,间断给予DSS饮用水;(7)AIH+DSS+Con A组(n=8);(8)Healthy+DSS+Con A组(n=8);(9)Control+DSS+Con A组(n=6)。16S r RNA基因测序对两组粪便上清菌群组成进行检测。每组小鼠分别给予灌胃两月共16次。DSS干预以6天为周期间断给予浓度为1%的DSS混合水。Con A干预组小鼠在处死前12h以13mg/kg的剂量予尾静脉Con A注射。处死前4小时给予FITC-dextran灌胃,处死小鼠取血后,分光光度计检测血浆FITC-dextran浓度,评价肠道通透性;取材检测各组血清ALT和AST水平评价肝功能;流式细胞术分析小鼠肝脏巨噬细胞浸润情况;通过对小鼠肝脏、脾脏、淋巴结进行需氧、厌氧细菌培养观察肠道菌群的移位情况。结果第一部分:万古霉素诱导的肠道菌群失衡加重小鼠免疫性肝损伤Con A+VANC组与Con A组相比,血清ALT、AST水平显著升高(P<0.01);肝脏病理结果显示Con A组可见肝实质、汇管区炎细胞浸润及肝细胞坏死,Con A+VANC组与Con A组相比汇管区炎细胞浸润以及肝细胞水肿明显加重。Con A+VANC组血清FITC-dextran浓度高于Con A组及Control组(P<0.05);盲肠内容物所检测到的6种短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸)中,丁酸在Con A+VANC组和VANC组的检测水平显著低于Con A组和Control组(P<0.05),其余5种短链脂肪酸亦有下降趋势;Con A+VANC组肝组织中IL-6表达水平较Con A组显著升高(P<0.05),IFN-γ、IL-10有升高趋势,但无统计学差异。Con A+VANC组肝细胞中自噬体标记蛋白LC3B-II及自噬底物蛋白SQSTM1/p62表达量有升高趋势,其中SQSTM1/p62的表达水平较Con A组有统计学差异(P<0.01)。第二部分:AIH患者肠道微生物可引起小鼠肠道通透性增加和菌群移位对AIH患者和健康对照者粪便上清液进行16S r RNA基因测序显示,在门水平,AIH患者肠道微生物中变形菌门、厚壁菌门的丰度较健康人肠道微生物显著升高。同时,在科水平,AIH患者肠道微生物多样性显著降低。在粪便上清灌胃和DSS饮用水的基础上给与Con A尾静脉注射诱导急性肝损伤模型后,AIH组小鼠血清ALT、AST水平较Control组、Healthy组有升高趋势。无论单独接受粪便上清灌胃还是同时给与DSS饮水的小鼠组间血清转氨酶水平均无明显差异。AIH组血清FITC-dextran水平较另外两组显著升高(P<0.05)。流式细胞术结果显示AIH+DSS+Con A组小鼠CD11b阳性细胞较Healthy+DSS+Con A组显著增多,提示AIH+DSS+Con A组肝组织中外周浸润来源的巨噬细胞增多。小鼠肝、脾、淋巴结细菌培养及鉴定结果显示,与Control组、Healthy组相比,AIH组小鼠的肝脏、脾脏、淋巴结中可培养出更多的需氧菌和厌氧菌。其中,AIH组所特有的细菌为福尔摩沙乳球菌、Lactobacillus sp.ARa2。Control组中,除了在一只小鼠的肝脏中发现了鼠乳杆菌/动物乳杆菌以外,淋巴结和脾脏中均未培养出细菌。另外,鼠乳杆菌/动物乳杆菌可在每组小鼠的肝脏或淋巴结中被发现。结论(1)万古霉素造成的小鼠肠道菌群失衡能够加重Con A诱导的急性肝损伤。万古霉素诱导肠道菌群失衡导致短链脂肪酸水平降低,进而影响肠屏障功能,增加肠道通透性,造成肠道抗原入肝增加。其加重肝损伤的机制与IL-6、IFN-γ水平升高有关。同时,Con A+VANC组肝细胞自噬水平相比于其它组有上调趋势,其在肝损伤中所起到的作用和机制有待进一步探索。(2)AIH患者肠道微生物多样性降低,相比于健康人,其肠道微生物中变形菌门、拟杆菌门丰度明显升高。AIH患者粪便上清液灌胃可加重Con A诱导的小鼠急性肝损伤。AIH组小鼠肠道通透性较Healthy组和Control组小鼠明显增大。AIH组肝脏外周浸润来源的巨噬细胞相比于另外两组明显增多。AIH组小鼠肝、脾、淋巴结中可培养鉴定出更多菌株,其中福尔摩沙乳球菌、Lactobacillus sp.ARa2为AIH组特有菌种。