研究背景和目的在体外,成体干细胞(adult stem cells,ASCs)通过细胞因子、基因修饰、机械牵拉等方法,能够被诱导分化为平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)。非直接接触共培养是诱导分化途径之一,更为简单易行。然而,迄今为止关于ASCs是否能够通过这种方式被诱导分化为SMCs尚无定论。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因体外易获取、无伦理学争议以及免疫源性小等特点,被认为是组织工程理想的种子细胞。因此,我们通过Transwell小室建立大鼠BMSCs和膀胱SMCs的非接触共培养模型,鉴定非接触共培养能否诱导BMSCs向SMCs分化,为体外干细胞分化提供新的诱导途径,并为下一步的研究建立细胞模型。干细胞分化效率低下严重阻碍了干细胞移植的临床应用。丁酸钠(sodium butyrate,NaB)是一种小分子的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi),能够诱导小鼠胚胎干细胞向胰腺和肝脏的祖细胞分化;亦可诱导BMSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化。然而,NaB能否诱导BMSCs向SMCs分化尚未有报道。因此,我们建立NaB联合共培养诱导BMSCs向SMCs分化的方法,以期提高干细胞的分化效率,为干细胞移植的临床应用提供实验依据。SMCs标志基因表达或者水平升高是SMCs分化的标志。SRF(serum response factor,SRF)是SMCs相关基因的转录因子(transcription factor,TF)之一,能够特异识别基因启动子区的CArG盒序列,启动SMCs标志基因的转录。研究表明SRF识别并结合DNA的过程受表观转录调控。组蛋白甲基化和乙酰化是表观转录调控最常见的方式。组蛋白尾部氨基酸被化学修饰后,局部致密的染色质结构得以松解,使TF易于识别并结合DNA序列,启动相关基因的转录。研究表明,组蛋白特定位点的甲基化和乙酰化与SMCs标志基因的转录有关。因此,我们提出假设:在BMSCs向SMCs分化过程中,组蛋白特定位点的甲基化和乙酰化修饰参与了SMCs相关基因的表达。通过揭示组蛋白化学修饰在其中的分子调控机制,为精确调控干细胞的分化提供实验依据。分化后的干细胞功能低下是阻碍干细胞移植应用的另一大障碍。因此,我们评估了分化后BMSCs的收缩功能,为其临床应用提供依据。表观转录调控的另一种机制是atp依赖的染色质重塑复合物。swi/snf染色质重塑复合物通过atp水解释放能量,松解致密的染色质结构,使tf更易接近并结合dna。brg1/brm(brahma-relatedgene1/brahma,brg1/brm)是swi/snf染色质重塑复合物的核心亚单位。有研究发现,brg1/brm和smcs标志基因表达有关,提示在bmscs向smcs分化过程中,brg1/brm可能参与其中。迄今为止,brg1/brm调控smcs标志基因转录的机制尚不明确。前期研究结果发现组蛋白特定位点的乙酰化促进smcs标志基因的表达。因此,我们提出假设:swi/snf染色质重塑复合物可能联合组蛋白特定位点的乙酰化修饰,共同调控smcs相关基因的表达。通过揭示brg1/brm在bmscs向smcs的分化中的作用,为表观遗传调控干细胞分化提供实验依据。实验方法1非直接接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化颈椎脱臼法处死3-4周龄雌性sd大鼠,无菌分离双侧的股骨和胫骨,通过贴壁培养方法获得bmscs;同时,逐层分离下腹部皮肤,膀胱颈处离断后通过胶原酶消化法获得smcs。bmscs用含10%fbs(fetalbovineserum,fbs)的dmem-f12培养剂培养,smcs用含10%fbs的dmem-hg培养剂培养,p3-4细胞用于实验研究。为了鉴定bmscs的干性,我们用流式细胞技术(flowcytometry,fcm)鉴定bmscs表面cd29、cd31、cd45、cd34的表达情况。为了鉴定smcs,我们用激光共聚焦显微镜技术(confocallaserscanningmicroscope,clsm)鉴定smcs的α-smc、calponin和sm-mhc蛋白表达情况。为了建立bmscs向smcs非接触共培养模型,我们将2×105smcs接种在transwell小室(直径小于3μm)的外室面,待其贴壁后将同等数量的bmscs接种在小室的内室面,悬在六孔板中,将bmscs和smcs培养基按照1:1比例混合后培养,不同时间点用细胞刮收集细胞。定量pcr(quantityreversetranscription-polymerasechainreaction,q-pcr)技术和wb技术(westernblot,wb)测定α-smc、calponin和sm-mhc在共培养的bmscs的表达情况。2组蛋白修饰在丁酸钠促bmscs向smcs分化中的调控机制为了测定nab对bmscs增殖的影响,我们用cck8测定不同浓度nab干预bmscs24h、48h和72h后的增殖情况。为了测定nab对bmscs向smcs分化的影响,我们用定量pcr技术测定不同浓度nab干预bmscs48h后α-smc、calponin和sm-mhc的mrna表达情况;clsm技术测定上述基因的蛋白表达。为了建立nab联合共培养促进bmscs向smcs分化的方法,我们先用不同浓度nab干预bmscs48h,然后再与smcs在transwell小室上共培养,最后在不同的时间点用细胞刮收获细胞。定量pcr方法测定α-smc、calponin和sm-mhc基因的表达情况,wb和clsm测定上述基因的蛋白表达情况。为了揭示nab联合共培养促进bmscs向smcs分化中,组蛋白特定位点的甲基化和乙酰化修饰在其中的作用,我们用chip-qpcr(chromatinimmunoprecipitation,chip)技术测定正常共培养的不同时间点以及有无nab干预的共培养bmscs的h3k43met、h3k273met、h3k9ace、h3ace和h4ace在smcs标志基因启动子区的富集量变化。组蛋白乙酰化状态是由hat和hdac共同调控。为了明确上述组蛋白乙酰化水平的变化是否由hdac引起,我们用clsm和wb技术对比nab干预前后bmscs的hdac1和hdac2蛋白表达的情况,并用chip-qpcr方法对比hdac1和hdac2在smcs标记基因启动子区的富集量的变化。基因的转录最终通过特异的tf启动,srf是smcs标志基因的转录因子之一。因此,最后我们用chip-qpcr技术对比有无nab干预的共培养组bmscs的srf在smcs标志基因启动子区富集量的变化。为了评估分化后的bmscs是否具有smcs的收缩功能。我们用fluo-8负载细胞后,用clsm技术对比分化前后bmscs的胞内游离钙离子浓度。另外,我们将不同的细胞悬于鼠尾胶原中,观察不同时间点胶原收缩面积大小,以此判断细胞是否具有收缩功能。3swi/snf染色质重塑复合物在bmscs向smcs分化中的调控机制我们首先通过英俊生物公司设计并合成靶向干扰brg1和brm基因编码区的小分子干扰rna片段(smallinterferingrna,sirna)三条,按照lipofectamine2000说明书操作步骤转染bmscs,定量pcr技术测定brg1和brm基因表达情况,最终筛选出最佳干扰片段。为了明确brg1和brm对bmscs向smcs分化的影响,我们用定量pcr和clsm技术,对比sibrg1和sibrm转染共培养的bmscs前后,α-smc和sm-mhc基因的表达情况。为了阐明brm是否联合组蛋白特定位点乙酰化修饰共同调控smcs标志基因的转录,我们首先用clsm技术对比sibrm转染前后共培养的bmscs的h3k9ace、h3ace和h4ace蛋白表达的情况,同时用chip-qpcr技术对比h3k9ace、h3ace和h4ace在α-smc和sm-mhc基因启动子区的富集量变化。为了明确brm联合h3k9ace、h3ace和h4ace促进共培养的bmscs向smcs分化是否通过srf转录因子实现,我们用clsm技术和chip-qpcr技术对比sibrm干扰前后共培养的bmscs的srf在smcs标志基因启动子区富集量的变化。实验结果1非直接接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化镜下,原代bmscs呈梭形,散在针尖样排列,贴壁生长,形成集落;原代smcs呈多边形,传代后胞内有较多空泡。fcm结果显示bmscs稳定表达干细胞标志cd29,不表达cd34、cd45和cd31。clsm结果显示smcs高表达α-sma、calponin和sm-mhc蛋白。定量pcr结果显示共培养72h后,bmscs的α-sma、calponin和sm-mhc基因表达水平明显升高。提示体外非接触共培养能够有效诱导bmscs向smcs分化。2组蛋白修饰在丁酸钠促bmscs向smcs分化中的调控机制1、为了测定nab对bmscs增殖和向smcs分化的影响,我们在bmscs培养基中加入不同浓度nab进行干预,cck8结果显示1.0mmol/lnab干预bmscs48h后能够对其增殖产生明显的抑制作用;定量pcr结果提示1.0mmol/lnab干预48h后能够显著提高bmscs的α-sma、calponin和sm-mhc基因的表达水平。提示nab能够诱导bmscs向smcs分化。2、为了建立nab联合共培养促进bmscs向smcs分化的方法,我们分别用不同浓度nab干预bmscs,然后与smcs共培养,在不同时间点收获细胞。定量pcr和wb结果显示1.0mmol/lnab显著提高了共培养的bmscs的α-sma、calponin和sm-mhc表达水平,另外nab干预的共培养,smcs标志基因在共培养的第二天可达高峰。clsm结果证实1.0mmol/lnab明显提高了共培养后的bmscs的smcs相关蛋白的表达。这部分结果说明1.0mmol/lnab联合共培养能够在共培养的第二天提高bmscs向smcs的分化效率。3、为了揭示在bmscs向smcs分化过程中,组蛋白甲基化和乙酰化修饰在smcs标志基因表达中的作用,我们用chip-qpcr技术对比正常共培养的不同时间点以及nab干预的共培养的bmscs中,h3k43met、h3k27met、h3k9ace、h3ace和h4ace在smcs标志基因启动子区的富集量的变化。结果显示随着共培养时间的延长,h3k43met在α-sma基因启动子区富集量减少;但nab干预后,其富集量反而增多。说明nab可能通过h3k43met提高了共培养的bmscs的α-sma基因表达水平。随着共培养时间的延长,h3k43met和h3k27met在calponin和sm-mhc启动子区富集量均明显减少;当nab干预后,其富集量甚至降的更低。说明h3k43met和h3k27met可能抑制calponin和sm-mhc的表达。随着共培养时间的延长,h3k9ace、h3ace和h4ace在α-sma、calponin和sm-mhc基因的富集量显著增加;当nab干预后,h3k9ace和h4ace的富集量甚至更高,而h3ace却明显降低。说明在共培养体系中,h3k9ace、h3ace和h4ace可能促进smcs标志基因的表达;而nab主要通过提高h3k9和h4乙酰化水平,促进smcs标志基因的表达。4、为了揭示上述组蛋白乙酰化状态的改变是否由hdac1和hdac2引起,我们用clsm技术和wb技术对比nab干预前后bmscs的hdac1和hdac2蛋白表达量的变化。结果显示nab干预的bmscs的hdac1表达量升高,而hdac2表达量明显下降。说明nab能够增加hdac1,降低hdac2的表达。为进一步揭示hdac1和hdac2表达量变化与smcs标志基因表达的关系,我们用chip-qpcr技术对比nab干预前后bmscs的smcs标志基因启动子区的hdac1和hdac2富集量变化,结果显示nab干预后hdac1富集量增加,而hdac2富集量明显减少。说明nab可能通过降低hdac2的表达以及在smcs标志基因启动子区的富集,提高了h3k9ace和h4ace水平,最终促进了smcs标志基因的表达。5、为了测定上述组蛋白乙酰化对smcs标志基因的调控是否通过srf转录因子启动,我们用clsm技术对比nab干预前后共培养的bmscs的srf蛋白表达情况,结果显示nab干预后,srf表达水平明显升高。为进一步揭示srf表达量增高和smcs标志基因的关系,我们用chip-qpcr技术对比nab干预前后,共培养的bmscs的smcs标志基因启动子区的srf富集量变化,结果显示nab干预后srf富集量明显增加。说明nab提高的组蛋白乙酰化,可能通过srf启动了smcs标志基因的转录。6、为了评估分化后的干细胞是否具有smcs功能,我们用fluo-8测定不同状态bmscs的胞内游离ca2+浓度,结果显示卡巴胆碱刺激后,分化的bmscs胞内游离钙离子浓度明显升高。另外,我们用含不同细胞的鼠尾胶原收缩面积的大小来评估分化后bmscs的收缩功能,结果显示悬浮分化的bmscs胶原,其收缩面积增大。说明分化后的bmscs具有smcs收缩功能。3swi/snf染色质重塑复合物在bmscs向smcs分化中的调控机制1、为了测定brg1/brm对共培养的bmscs向smcs分化的影响,我们用定量pcr技术测定sibrg1和sibrm转染共培养的bmscs前后对α-sma和sm-mhc基因的影响。结果显示sibrm转染后α-sma和sm-mhc基因表达水平显著下降;而sibrg1基因干扰对其表达没有明显影响。clsm结果显示brm基因抑制后,共培养的bmscs的α-sma和sm-mhc蛋白表达明显降低。说明在bmscs向smcs分化过程中,brm而不是brg1促进smcs标志基因的表达。2、为了测定brm促进smcs标志基因的表达是否通过srf和myocardin实现,我们用clsm对比brm抑制前后共培养的bmscs的srf和myocardin表达变化,结果显示brm抑制后srf和myocardin表达降低。为了测定srf表达降低和smcs标志基因的关系,我们用chip-qpcr对比brm干扰前后共培养的bmscs的smcs标志基因启动子区srf的富集量变化,结果显示brm抑制后srf在α-sma和sm-mhc基因的富集量显著降低。说明brm可能通过srf促进smcs标志基因的转录。3、为了测定BMSCs向SMCs分化过程中,BRM是否联合组蛋白乙酰化修饰调控SMCs标志基因的表达,我们用ChIP-qPCR技术对比siBRM干扰共培养的BMSCs前后,H3K9ace、H3ace和H4ace在α-SMA和SM-MHC基因启动子区富集量的变化,结果显示siBRM降低了H3K9ace、H3ace和H4ace的富集量。说明在BMSCs向SMCs分化过程中,BRM可能联合H3K9ace、H3ace和H4ace调控SMCs标志基因的表达。结论1、在体外BMSCs通过非直接接触共培养模型能够向SMCs分化。2、正常共培养体系中,BMSCs在与SMCs共培养的第三天,能够被诱导分化为SMCs;1.0mmol/L NaB干预后,在共培养的第二天能够显著提高BMSCs向SMCs分化效率,同时增强了分化后BMSCs的收缩功能。3、正常共培养体系中,H3K43met和H3K27met对SMCs标志基因的转录起到抑制作用,而H3K9ace、H3ace和H4ace则促进了这些基因的表达。NaB干预的共培养,可能通过提高H3K9ace和H4ace促进SRF启动的SMCs标志基因的转录。在此过程中,H3K9ace和H4ace水平的提高可能和NaB降低HDAC2表达并降低它在SMCs标志基因启动子区的富集有关。4、在BMSCs向SMCs分化中,BRM而不是BRG1能够促进SMCs标志基因的表达。机制可能是BRM联合H3K9ace、H3ace和H4ace,通过SRF启动了SMCs标志基因的转录。综上所述,我们通过非直接接触共培养模型诱导BMSCs向SMCs分化。通过NaB提高了共培养的BMSCs向SMCs分化的效率,同时增强了分化后细胞的收缩功能。深入揭示了其中的分子调控机制:NaB可能通过降低HDAC2的表达及其在SMCs标志基因启动子区的富集,从而提高了H3K9ace和H4ace水平,最终通过SRF启动SMCs标志基因的转录。另外,阐明了BRM而不是BRG1可能联合H3K9ace、H3ace和H4ace,通过SRF和Myocardin,提高了SMCs标志基因在共培养的BMSCs的表达。我们的研究不仅建立了体外提高干细胞分化效率及增强分化后细胞收缩功能的方法,更揭示了表观转录调控在其中的分子调控机制,为干细胞移植治疗SUI以及其他组织器官缺损性疾病提供实验依据。