新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)强毒引起的能感染多种禽类的急性、高度传染性疫病。NDV目前只有一个血清型，但在遗传进化上可将毒株划分为ClassⅠ和ClassⅡ两大分支。ClassⅠ分支有9个基因型，主要以弱毒株形式存在于水禽中。ClassⅡ分支也由9个基因型组成，其中Ⅰ～Ⅳ型和Ⅸ型为早期基因型毒株，Ⅴ～Ⅷ型为晚期基因型毒株。自1926年ND首次爆发以来，造成四次世界大流行的强毒株和现阶段常规弱毒疫苗株均属于ClassⅡ分支。流行病学调查发现，近年来NDV强毒分离株中都有早期与晚期基因型毒株的存在，但基因Ⅶd亚型NDV在分离毒株中占绝对优势，是当前世界流行的主要基因型毒株。与早期基因型强毒株相比，基因Ⅶd亚型NDV对宿主免疫系统的侵嗜力更强，造成的组织损伤主要表现为免疫器官的广泛、严重的坏死。为了研究Ⅶd亚型NDV对宿主免疫系统侵嗜性增强的分子机制，本文以早期毒株Herts/33和Ⅶd亚型毒株JS-3-05-Ch为模式病毒，以重要免疫器管脾脏为研究对象，对模式病毒感染后鸡脾脏的组织病理学变化进行研究比较，结合双向凝胶电泳技术（two-dimensional gelelectrophoresis，2-DE）和基质辅助激光解析电离飞行质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定的比较蛋白质组学方法，比较基因Ⅶd亚型NDV和基因Ⅳ型NDV感染SPF鸡后脾脏蛋白的表达差异，并对差异表达的蛋白进行功能分析，探讨早晚期毒株对免疫系统侵嗜性产生差异的原因。此外，研究了早期基因Ⅳ型毒株和流行毒株对免疫鸡群的感染性差异，旨在解析免疫鸡群中基因Ⅶd亚型NDV流行的原因。　　1.基因Ⅶd亚型和Ⅳ型NDV对鸡脾脏的感染与致病性分析　　本实验选取基因Ⅶd亚型NDV（JS-3-05-Ch株）和基因Ⅳ型NDV（Hert/33株）分别感染SPF鸡，观察两毒株人工感染SPF鸡后，脾脏的大体病变、组织学变化以及抗原定位。体内致病实验结果表明，两毒株人工感染SPF鸡后，引起SPF鸡的发病率和死亡率均为100％，均出现了明显的ND症状和病变，但是两组的死亡时间差异显著，Ⅶd亚型NDV毒力更强，接种鸡的死亡时间早于Hert/33株。两毒株感染鸡脾脏产生的病变存在显著性差异。基因Ⅶd亚型NDV感染后，脾脏病变表现为肿大，有明显白色坏死点及以细胞变性坏死为特征的广泛性组织损伤;而基因Ⅳ型NDV感染后，脾脏则没有明显的眼观病变，感染后期脾脏有萎缩趋势。组织学变化观察结果与大体病变结果相符，基因Ⅶd亚型NDV感染组的鸡脾脏内淋巴细胞严重变性坏死，淋巴细胞显著减少;而基因Ⅳ型NDV感染组的鸡脾脏均没有出现淋巴细胞的坏死病变，在鸡脾脏中仅表现为动脉周围淋巴鞘淋巴细胞数量减少。透射电镜观察脾脏超微结构结果显示，两种基因型病毒感染后，淋巴细胞均表现明显的凋亡现象，但Ⅶd亚型NDV感染组的鸡脾脏内线粒体的病变较基因Ⅳ型NDV感染组更加显著。另外，两个毒株感染组的脾脏中都能检测到病毒抗原，病毒抗原主要定位于脾脏的淋巴细胞和巨噬细胞的胞浆内。荧光定量QRT-PCR检测感染后脾脏中病毒相对含量的结果显示，两毒株感染组脾脏中的病毒含量在感染后表现出不同的变化趋势，基因Ⅶd亚型NDV感染鸡脾脏中的病毒相对含量明显高于基因Ⅳ型NDV感染组。　　2.SPF鸡感染Ⅶd亚型和基因Ⅳ型NDV强毒后脾脏的比较蛋白质组研究　　为了进一步研究基因Ⅶd亚型NDV(JS-3-05-Ch株)和基因Ⅳ型NDV(Hert/33株)感染SPF鸡后对脾脏的致病特征差异机制，本研究以感染了以上两种NDV SPF鸡的脾脏为研究对象，采用双向凝胶电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定技术(MALDI-TOF-MS)的比较蛋白质组研究方法，结合生物信息学手段，分析两株NDV感染SPF鸡后48h、72h和96h三个时间点脾脏蛋白表达动态。结合STRING和IngenuityPathway Analysis(IPA)数据库软件，对差异蛋白的功能、分类、细胞定位、可能参与的信号通路以及蛋白质相关功能网络等方面进行进一步分析，探讨两种不同基因型NDV强毒感染后引起脾脏中差异表达蛋白的类型和功能，继而进一步分析基因Ⅶd亚型NDV和基因Ⅳ型NDV引起脾脏病变差异的机制。　　双向凝胶图谱的差异表达分析显示，蛋白差异表达主要发生在感染后72h和96h。共有168个蛋白点出现了显著的差异表达，并且部分蛋白点的表达水平在不同的感染组表现出不同的变化趋势。采用MALDI-TOF-MS质谱法对168个差异表达蛋白点进行质谱鉴定，结果成功鉴定了132个蛋白点，对应108种蛋白质。根据蛋白的功能不同，这些差异表达蛋白涉及细胞死亡相关蛋白、细胞骨架蛋白、应激反应蛋白、泛素蛋白酶体通路相关蛋白、信号转导蛋白、翻译调节因子、蛋白质翻译和合成、RNA加工和合成、代谢相关蛋白、运输蛋白、胞吞作用相关蛋白等。应用Western-blot分析方法验证了β-actin的蛋白表达水平，其结果与2-DE的分析结果相符。分析结果显示，两种基因型的病毒均能引起SPF鸡脾脏蛋白质组发生比较复杂的改变，包括诱导机体产生强烈的天然免疫应答、改变细胞骨架、影响泛素-蛋白酶体通路的稳定、细胞死亡等。但与基因Ⅳ型NDV相比，基因Ⅶd亚型NDV引起了更多脾脏蛋白的差异表达，并且基因Ⅶd亚型NDV造成鸡脾脏特征性病变与其诱导宿主产生更为强烈的宿主天然免疫应答，严重影响细胞骨架系统和UPP通路的稳定性，以及引起更为强烈的细胞凋亡及坏死密切相关。这些为解释基因Ⅶd亚型NDV与基因Ⅳ型NDV感染后引起脾脏不同病理学变化的原因，及基因Ⅶd亚型成为当前新城疫病毒优势基因型的生物学机制提供了线索。　　3.免疫鸡群中基因Ⅶd亚型与Ⅳ型新城疫病毒感染性的差异分析　　将100只3周龄SPF鸡随机分为3组，组l和组2分别用20μl剂量的基因Ⅶ型NDV油佐剂灭活疫苗（A-Ⅶ株）及鸡新城疫油佐剂灭活疫苗（LaSota株）经颈部皮下注射免疫，每种疫苗免疫40只SPF鸡，免疫后21天，采血分离血清，分别用新城疫病毒A-Ⅶ株、LaSota株抗原检测血清中HI抗体效价后，每种疫苗免疫组分别经肌肉注射1050ELD50的基因Ⅶd亚型强毒株JS-3-05-Ch和基因Ⅳ型强毒株Herts/33株，20只/毒株，攻毒对照组为10只/毒株，攻毒后观察10天，每天记录对照组和免疫组的发病死亡情况，并于攻毒后第3、5、7、9天采集喉头和泄殖腔拭子，用于病毒分离。结果显示，LaSota油苗免疫组鸡对JS-3-05-Ch和Herts/33攻毒保护效率分别为80％和95％，表明我国常用疫苗株LaSota对基因Ⅶd亚型流行株的保护率较差，而A-Ⅶ油苗对两强毒株的攻毒保护率均为100％。免疫攻毒后，基因Ⅶd亚型毒株JS-3-05-Ch攻毒组排毒率明显高于Herts/33株攻毒组。免疫21d后抗体水平为6-710g2试验鸡的排毒数据分分析结果显示:组1和组2试验鸡在攻毒后的第3、5、7天，Ⅶd亚型JS-3-05-Ch攻毒组鸡的排毒阳性率均高于Herts/33株攻毒组，且攻毒后第5和第7天，在LaSota油苗免疫组中，JS-3-05-Ch感染鸡的排毒量明显高于Herts/33感染鸡。　　另外，取血清抗体HI效价均为610g2的试验鸡30只，分别以强毒株JS-3-05-Ch和Herts/33株攻毒，于攻毒后第3天和第5天采集脾脏组织样品，检测免疫相关细胞因子的表达情况。结果显示:除了IL-10和IFN-γ外，JS-3-05-Ch感染鸡脾脏中的IL-1β、IL-6、IL-18、LITAF、IFN-α和IFN-β的表达量均低于Herts/33感染组，这些细胞因子的联合下调表明与早期基因型毒株相比，Ⅶd亚型NDV对免疫鸡的免疫应答具有更强的抑制能力，此可能是免疫鸡群中感染Ⅶd亚型NDV强毒株的重要原因之一。　　全文小结　　(1)与早期Ⅳ型毒株相比，基因Ⅶd亚型NDV感染SPF鸡后能引起脾脏产生严重的广泛性坏死病变，且可诱导脾脏淋巴细胞发生更加显著的线粒体病变。　　(2)强毒NDV的感染能引起宿主产生强烈的天然免疫应答，促进脾脏组织细胞的凋亡和坏死;破坏宿主细胞骨架;影响泛素-蛋白酶体通路的稳定。　　(3)基因Ⅶd亚型JS-3-05-Ch株造成鸡脾脏特征性坏死病变可能与其在脾脏中具有更高的病毒复制水平、诱导更为强烈的宿主天然免疫应答和细胞大量的凋亡及坏死有关。　　(4)常规疫苗株LaSota对基因Ⅶd亚型NDV毒株保护效率较差，且与早期基因型毒株相比，Ⅶd亚型NDV对免疫鸡的免疫应答具有更强的抑制能力。