背景与目的：肝癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,在全球恶性肿瘤发病率和死亡率分别为第七位和第五位,我国卫生部统计得出肝癌死亡率占肿瘤死亡率的第二位。肝癌分原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)、胆管细胞癌(cholangio carcinoma ICC)和混合细胞癌。其中肝细胞肝癌占90%以上。手术切除和肝脏移植是目前肝癌治疗最有效的手段,但术后高复发率严重影响患者预后,有些患者即便行根治性肝癌切除术后仍可能复发,这些和肝癌的生物学特性有关。大量文献及既往临床研究证实：肝癌根治性切除术后第1年内复发率最高,而且复发患者的预后也较其他恶性肿瘤晚期复发的患者差。因此肝癌术后早期复发已经成为影响患者预后的重要因素。从肝癌早期复发的生物学特性开始研究,找出影响肝癌发生的关键信号通路及靶基因,有利于更早预测诊断肝癌高危人群,并采取相应地有效措施来提高肝癌根治性的可切除术率,确保手术疗效。传统的肝癌治疗的方法有一定的滞后性。因此,有必要结合引响肝癌发生、发展过程的多因素,运用基因组群分析方法从分子水平上发现肝癌复发及侵袭转移机制。找出与肝癌复发侵袭相关的敏感基因作为治疗肝癌的分子靶标,为临床上根治肝癌带来新的思路。MicroRNA是一类新发现的非编码小分子RNA,是哺乳动物基因组中最为丰富的调节基因之一,预测其可能调控着至少三分之一的人类编码基因而miRNA本身并不编码蛋白,它通过与特异的靶mRNA结合,降解或抑制其翻译过程,从而降低相应靶基因的表达调控。到目前为止人类发现了1000多个miRNAs,其中已被证实的miRNA就达500多个。miRNA的具体如何调控调节靶蛋白的翻译目前尚不清楚。随着对miRNA功能研究的深入,越来越多的研究表明miRNA与人类疾病的发生发展密切相关,特别是在肿癌的发生、复发、转移、侵袭中起到关键作用,目前已经是肿瘤研究的热点之一。与肝癌相关的内源性niRNA与肿瘤的关系近期的研究发现,不同类型的肿瘤有不同组合的miRNAs异常表达谱,提示肿瘤的miRNAs表达具有其组织特异性。有学者研究发现肝癌组织中miR-18. precursor miR-18、miR-224较正常组织有更高水平的表达,miR-199a、miR-195、 miR-200a、miR-125a较正常组织有低水平表达。而在大鼠肝癌组织中,let-7a、 miR-2、miR-23、miR-130、miR-190、miR-17-92都有表达水平的上调,但肝组织富集的miR-122在癌组织中表达水平明显下调。上述异常表达的miRNA在功能分析研究中显示可能与肝癌细胞的分化、信号转导相关。miRNA是完全天然的内源性反义调节因子,基于miRNA的基因治疗可能成为抑制肿瘤恶化的有效途径。目前有关肝癌的研究报道主要集中于模拟内源性miRNA,增强其对靶基因的作用效能；或以niRNA为靶点设计小分子物质拮抗miRNA的作用,如niRNA反义寡聚(脱氧)核苷酸(anti-miRNA oligonucleotides,AMOs)、锁定核酸修饰的寡核苷酸(locked nucleic acid, LNA-modified oligonucleotides)以及miRNA拮抗分子(antagomis)等。而针对目标基因设计靶向特异性miRNA作用于肝癌细胞方面的研究,国内外尚未见报道。最近有数据表明某些特定作用的microRNA在肿瘤细胞内的过表达或缺失与临床上不同亚型的肿瘤细胞的转移与侵袭性功能密切相关。研究表明mir-144在许多肿瘤中表达失控。如乳腺癌、白血病、肝癌、少突角质细胞瘤等疾病中异常表达。另外,mir-144通过下调Rb1通路途径发挥乳腺癌细胞的增殖效应。众多的数据表明mir-144在肿瘤的发生、发展中扮演着关键的调节因素。研究[1]发现,miR-200c和miR-200b通过锌指结构的E-盒结合同源异型盒(zinc-finger E-box binding homeobox,ZEB)来上调E-cadherin表达抑制上皮-间充质转分化(epithelial-mesenchchymal transition,EMT)。值得研究的是ZEB1和ZEB2也能与miR-200家族上游的启动子E-box或Z-box结合抑制miR-200家族的转录[2]。提示：miR-200家族与靶基因ZEB之间互相通过负反馈调节二者之间的表达平衡。miRNA在肿瘤中有可能起促癌作用也有可能起抑癌作用,甚至在微环境条件变化下既起癌基因作用又起抑癌基因的作用。Let-7家族、miR-206、miR-335在乳腺癌中起抑癌作用[3-7];miR-378、miR-373、miR-21、miR-lOb等在乳腺癌中起促癌作用[8--10]。目前有关与肝癌相关miRNA的研究很多,而与肝癌术后早期复发相关。miRNA表达谱及miRNA在肝癌复发转移的分子机制尚不清楚。国内外研究发现mir-144在肝癌肿瘤中表达下调,其异常表达在多种肿瘤中得到证实。推测mir-144可能在肝癌中发挥抑癌基因的作用。为进一步研究mir-144在肝癌中的作用,本研究通过microRNA基因芯片筛选出mir-144在肝癌中表达上调,初步证实mir-144在肝癌中发挥促癌基因的作用。在以后的研究中将mir-144作为肝癌治疗的靶点,为肝癌的分子分型及临床诊治提供新的思路。MicroRNA通过调节细胞周期蛋白来发挥促癌以及抑癌作用,有学者提出在正常细胞中生理浓度的microRNA抑制调节细胞周期靶蛋白的表达。当microRNA表达过高就抑制细胞周期靶蛋白的调节,阻止细胞周期分化,细胞处于癌变低分化状态。有关microRNA在肝癌中的研究报道[11]：miR-195抑制其对应的靶基因细胞周期蛋白CDK6和D1而抑制肝癌细胞从G1期向S期转化。而且miR-195通过抑制RB蛋白的磷酸化而阻止下游靶基因的活化。提示：miR-195在肝癌产生的分子机制方面以及细胞周期调节方面具有潜在的意义。由于肿瘤组织的特异性,使得miRNA引响到肿瘤的分子分型,并在临床疾病诊治方面显得尤为重要。而随着肿瘤相关miRNAs及其靶基因的发现以及分子机制的研究使得有些问题值得研究者思考：在整个基因调控网络中miRNA只是起间接调控作用,它并不是单一或某些特定基因的表达产物。一个miRNA可同时或同步调节多个靶基因的表达,如果只是改变单个miRNA可能会影响到其他未知的靶基因。相反,单一的靶基因也可能同时或同步被多个miRNA调控。单一的miRNA可能不足以影响到特定靶基因的表达。因此,目前把miRNA应用于临床诊断和治疗还为时尚早,但对miRNA具体作用机制以及对靶基因的调控还需进一步更加细致深入的研究。第一部分microRNA芯片技术在肝癌术后早期复发相关microRNA的筛选研究目的：利用microRNA芯片技术分析比较两组不同复发倾向肝癌组织miRNA表达谱的差异,获得与原发性肝癌早期复发密切相关的microRNAs方法：通过对行肝癌切除患者术前签署知情同意书,收集2002年至2010年于我院接受肝癌根治性手术治疗的原发性肝细胞癌患者的手术标本500余例。建立了一套数据完整肝癌标本库系统,并制定完整的肝癌患者登记表且收集患者临床各项病历资料及随访资料。标本收集好之后迅速转至超低温冰箱长期冻存,把所收集的标本及临床资料统一编号,及时备案。现从我院肝癌数据标本库中挑选10例原发性肝癌深低温冻存组织标本。其中5例早期复发组(5例术后1年内肝内出现复发病灶)；5例非早期复发组(5例术后超过2年未出现肝内复发病灶)。首先采用分子生物学方法提取两组肝癌组织总RNA并行CY3标记；然后将所标记后的RNA与Agilent公司的miRNA芯片上进行杂交反应；再利用SAM2.1软件进行分析筛选。采用Cluster3.0对差异表达的miRNA聚类分析。结果：本研究通过芯片实验共筛选获得7个差异表达的microRNAs,其中4个表达上调,分别为mir-602、mir-451、mir-144、mir-486-5p表达上调。(其中mir-602上调2.29倍、mir-451上调3.73倍、mir-144上调5.28倍、mir-486-5p上调2.5倍,所用的P<0.05)；3个表达下调分别为mir-551b、mir-96、mir-502-3p表达下调。(其中mir-551b下调0.21倍、mir-96下调0.12倍、mir-502-3p下调0.042倍所有的P<0.05)结论：利用microRNA基因芯片能快速、高通量的筛选出与原发性肝癌术后早期复发密切相关的mircroRNA,该研究为基于肝癌相关microRNA的基因治疗奠定了基础。第二部分实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测mir-144、mir-502-3p在肝癌组织中相对表达水平目的：运用qRT-PCR技术在大样品的基础上验证miRNA基因芯片所预测mir-144、mir-502-3p在肝癌早期复发组与非早期复发组之间miRNA表达水平的差异。方法：从我院肝癌数据标本库中挑选82例原发性肝癌深低温冻存组织标本。其中50例早期复发组(50例术后1年内肝内出现复发病灶)；32例非早期复发组(32例术后超过2年未出现肝内复发病灶)。利用分子生物学方法提取总RNA,以U6为内参基因。分别合成mir-144、mir-503-3p和U6的特异性的引物,以SYBR Green染料法对mir-144.mir-502-3p、U6的特异性扩增引物行qRT-PCR实时荧光检测。结果运用ABIsds2.1软件分析,绘制扩增曲线、溶解曲线。计算比较早期复发组与非早期复发组两组间mir-144、mir-502-3p在肝癌中表达的相对表达量的差异。结果：qRT-PCR实验结果与miRNA芯片筛选的结果一致。qRT-PCR结果显示：mir-144、mir-502-3p两基因引物的扩增产物均为单峰。mir-144在早期复发组比非早期组上调6.944倍,mir-502-3p在早期复发组比非早期复发组下调0.253倍。两组比较在统计学上均有显著的差异。利用生物信息学方法预测miR-144靶基因可能为Rb1, miR-502-3p靶基因可能为SET。结论：mir-14、mir-502-3p与肝癌早期复发密切相关,mir-144、mir-502的表达可能促进肝癌的复发、侵袭和复发。可作为肝癌早期诊断的分子标记物和肝癌靶向治疗的新靶点。