壳聚糖酶是一种专一性降解壳聚糖的水解酶,可用于制备功能性的壳寡糖,又可作为生物控制剂,提高植物的抗病能力。 从本实验室保存菌株出发,在温度30℃,转速100rpm,pH6.0,通气量8L/min条件下进行发酵罐放大发酵培养,72小时后酶活达24U/mL。发酵粗酶液经离心,20%～70%硫酸铵分级盐析,Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephacryl S-100凝胶过滤后,得到电泳纯的壳聚糖酶,纯化后酶的比活力为1336U/mg,纯化了28.9倍。酶的性质研究表明,其分子量为66.2kD,酶解最适温度为55℃,最适pH为6.0。该酶在45℃以下稳定,4℃冷藏15天后酶活保持在95%。Mn²⁺对酶活有促进作用,Cu²⁺,Fe³⁺,Hg²⁺对酶活有抑制作用,小分子物质EDTA与SDS对酶活有抑制作用,而IAA和β-巯基乙醇对酶活稍有促进作用。该壳聚糖酶为专一性酶,动力学参数Km值为5.15mg/mL。此酶的活性明显高于已报道的其他壳聚糖酶,通过此酶大规模生产壳寡糖在工业生产上极有应用价值。 对酶降解法制备壳寡糖的生产工艺进行研究,分别考察了温度、pH、底物浓度、脱乙酰度、酶用量、反应时间对酶促反应的影响。酶解产物进行HPLC分析,通过Bio-Gel P₄柱对酶解产物进行初步分离,并对分离产物TLC分析。结果表明,此酶是一种内切酶,以内切方式水解壳聚糖β-（1,4）糖苷键,降解的最佳温度为45℃,最佳pH6.0,最佳底物浓度为6%（w/v）,HPLC显示脱乙酰度的提高酶降解产物数均分子量将降低,9.08U酶液至少能降解1g壳聚糖底物（5cp,DD90%）,24h后酶解反应达到平衡。用P₄柱分离得到聚合度20以上、10～20、10以下的壳寡糖。在以上最佳条件下酶解得到一批壳寡糖,对其部分质量标准进行评价,具体如下:外观,淡黄色粉末;pH7.35;水溶性,>99.9%;水分,12.1%;灰分,1.65%;重金属铅含量2.06ppm;平均分子质量:2400。 对YJ02菌株的发酵液的生物学功能进行初步研究,发现发酵液对3种植物致病菌均有抑制作用。酶解得到不同分子量组分的壳寡糖的作用于体外Hela细胞,经MTT检验,显示与正常对照组无显著差异,表明其在体外无抑制Hela细