中药方剂是几千年来中国人民用以抵抗疾病的一套奇特的药物系统。方剂配伍优点明显,它能够增强药物疗效、减低药物毒性、扩大药物治疗范围等。然而方剂也因其组成复杂,有效成分多样,导致其药效作用物质基础不清晰,作用机制、配伍规律不明确,成为中药现代化的一个重要阻力。因此探索中药方剂的物质基础、配伍规律、作用机制已成为中药现代化研究的新热点。本课题组前期以参附方为代表,从化学、药代、药效、毒理等方面对中药配伍减毒增效机制进行了较系统的探索,但是在药理机制方面研究较少。本课题则进一步在药理机制层面,从细胞自噬角度探讨参附配伍减毒增效的作用机制,以期完善对参附配伍减毒增效规律的认识,拓展中药配伍减毒增效机制的研究思路。本文首先以阿霉素建立心肌细胞自噬损伤模型。采用CCK-8、透射电镜、荧光染色、Western blot等方法分别检测阿霉素作用于H9c2细胞后,心肌细胞的增殖以及自噬变化。结果显示,阿霉素能显著引起H9c2细胞活力下降,并导致H9c2细胞的自噬相关结构增加,与此同时自噬标志性蛋白LC3B由LC3B-I转变为LC3B-II的量增加及p62蛋白表达降低。以上结果证明了阿霉素可以引发心肌细胞自噬性损伤。根据以上实验结果确定了建立细胞自噬损伤模型的方法是1μmol·L-1阿霉素处理细胞12 h。其次,通过人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re预处理H9c2细胞6 h,然后与5μmol·L-1阿霉素共处理24 h后检测细胞活力发现,人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1可显著抑制阿霉素引起的心肌细胞活力下降而人参皂苷Re的抑制效果则不明显。采用荧光染色和Western blot方法分别检测阿霉素和人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1联用后对H9c2细胞自噬的影响。结果显示,人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1均能抑制阿霉素诱导的自噬相关结构增加、LC3B-I转变为LC3B-II的增加以及p62蛋白表达的降低。以上结果提示,人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对阿霉素诱导心肌细胞死亡具有保护作用,这种作用可能是通过调节自噬产生的。再次,应用Western blot法分别检测了乌头碱、次乌头碱、中乌头碱作用于H9c2细胞后,心肌细胞自噬的变化。结果显示,随着乌头碱、次乌头碱浓度的升高以及给药时间的延长,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ先升高后降低,同时与对照组相比,p62蛋白表达变化不明显。提示乌头碱、次乌头碱可以诱导H9c2心肌细胞自噬。而中乌头碱不同浓度处理细胞12 h后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ无明显变化,但LC3B-Ⅱ升高、p62蛋白则出现升高趋势。10μmol·L-1中乌头碱不同时间处理细胞后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62均出现升高趋势。以上结果提示,中乌头碱可能阻断了H9c2心肌细胞自噬。最后,应用透射电镜、荧光染色、Western blot等多种方法检测了乌头碱对大鼠原代心肌细胞自噬的影响。结果显示,与对照组相比,给予乌头碱后在透射电镜下可明显观察到细胞中的自噬相关结构;荧光染色结果显示,与对照组相比,给予乌头碱后细胞绿色荧光明显增强且成斑点状出现在细胞中;Western blot结果显示,与对照组相比,给予乌头碱后细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ升高且p62蛋白表达降低。以上结果再次证明乌头碱可以导致心肌细胞自噬活化。将人参皂苷Rg1与乌头碱共孵育于原代心肌细胞12 h后,观察原代心肌细胞自噬变化。实验结果显示,与对照组相比,乌头碱组细胞绿色荧光明显增强且成斑点状出现在细胞中,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ明显升高,而人参皂苷Rg1与乌头碱共处理组绿色荧光较乌头碱组则明显减弱且大部分呈弥散状分布于细胞中,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ也小于乌头碱组。以上结果提示,人参皂苷Rg1可以抑制乌头碱诱导的原代心肌细胞自噬活化。综上所述,本文证明了人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1对阿霉素引起的心肌细胞毒性具有保护作用,这种保护作用与抑制阿霉素诱导的自噬活化有关;乌头碱、次乌头碱、中乌头碱可以扰乱心肌细胞正常的自噬状态,其中乌头碱、次乌头碱可以诱导自噬,而中乌头碱则可以阻断自噬;人参皂苷Rg1可以抑制乌头碱引起的大鼠原代心肌细胞自噬活化。以上结果为参附配伍减毒作用提供了参考,深化了对参附配伍规律的认识,为中药配伍减毒增效规律的研究提供了新尝试。