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[目 的]前列腺癌(PCa)是最常见的恶性肿瘤之一,也是西方男性癌症的第二大死因。多年以来,晚期前列腺癌的治疗主要基于雄激素受体控制的增殖途径的调控,而不可避免的最终进展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),而对于CRPC的治疗一直缺乏比较有效的治疗手段。免疫学在近几年的突破性的发展,也为前列腺癌的医治供给了新的启发。前列腺特异性膜抗原(PSMA)是目前研究的热门靶点,其能够靶向前列腺癌的特性已经得到共识,因此制备一个全新的能够靶向前列腺癌细胞的单克隆抗体无论对于前列腺癌的治疗还是诊断都有重要的意义。本课拟制备PSMA全长重组蛋白,并用该蛋白免疫小鼠最终获得一个全新的能够靶向PSMA的单克隆抗体。[方法]1.通过基因重组技术与真核细胞瞬时转染技术制备PSMA重组蛋白提取LNCaP细胞中总RNA后,通过反转录PCR技术合成cDNA后,用所设计的引物从cDNA中合成FOLH1基因,通过同源重组技术将表达载体与FOLH1基因相连接合成质粒,通过转化感受态细胞将质粒大量扩增,通过瞬时转染技术将质粒转入悬浮培养的哺乳动物细胞中大量表达PSMA重组蛋白,通过亲和层析技术将其纯化,通过SDS-PAGE电泳等实验检测PSMA重组蛋白,鉴定目的蛋白是否成功表达。2.PSMA单克隆抗体的制备用PSMA重组蛋白免疫BALB/c小鼠,当小鼠血清效价达标时取出小鼠脾脏与SP2/0细胞融合制备杂交瘤细胞,通过ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,通过有限稀释法将杂交瘤细胞亚克隆得到表达单一抗体的杂交瘤细胞,再将其注射入小鼠腹腔制备腹水抗体,通过亲和层析技术将其纯化,最终获得单克隆抗体。3.鉴定制备的单克隆抗体的特异性及其内化能力通过Western blot检测单克隆抗体对于PSMA重组蛋白的特异性,通过流式细胞学检测单克隆抗体对于表达PSMA的前列腺癌细胞的特异性,通过细胞免疫荧光检测单克隆抗体对于表达PSMA的前列腺癌细胞的特异性以及内化的能力。[结 果]1.通过基因重组技术与真核细胞瞬时转染技术制备PSMA重组蛋白DNA凝胶电泳在2000bp上方有明显条带,送检测公司测序后结果显示仅有两个碱基突变,证明FOLH1基因表达成功。使用SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色对PSMA重组蛋白进行检测,结果显示在80kDa-115kDa区域内出现一条较为明显的条带,表示PSMA重组蛋白表达成功。2.PSMA单克隆抗体的制备通过ELISA检测3只小鼠经过5次免疫最终效价都达到128800以上,表明免疫成功。3.鉴定制备的单克隆抗体的特异性及其内化能力通过Western blot实验在PSMA重组蛋白电泳处有明显条带,表明单克隆抗体能够特异性识别PSMA重组蛋白。通过流式细胞学检测,表达PSMA的前列腺癌细胞荧光强度明显高于阴性对照组,而不表达PSMA的前列腺癌细胞荧光强度与阴性对照组几乎无差别,表明该单克隆抗体具有特异性识别表达PSMA的前列腺癌细胞的功能。通过细胞免疫荧光检测,表达PSMA的前列腺癌细胞能够明显观察到荧光信号,而不表达PSMA的前列腺癌细胞则几乎观察不到荧光信号,并且在表达PSMA前列腺癌细胞内部同样能够观测到明显的荧光信号,表明抗体不仅具有特异性同时能够内化进细胞内部。[结 论]本课题通过基因重组技术制备了FOLH1全基因,并将该基因与真核载体相连接在哺乳动物细胞中表达出了 PSMA重组蛋白,并用该蛋白免疫小鼠,最终获得一株全新的能够靶向PSMA的单克隆抗体,并且通过Western blot检测证明该单克隆抗体能够特异性的识别PSMA蛋白。通过流式细胞学检测证明该抗体能够特异性识别表达PSMA的前列腺癌细胞,并且不识别不表达PSMA的前列腺癌细胞。通过细胞免疫荧光检测,证明该单克隆抗体不仅识别表达PSMA的前列腺癌细胞而且能内化入细胞内部。该单克隆抗体对于前列腺的诊断与治疗以及基础实验都有重大意义。