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第一部分人骨髓间充质干细胞体外培养与鉴定[目的]运用实验室已经成功创建的人骨髓间充质干细胞培养方案,分离、培养和鉴定hMSCs,为后续研究提供充足的干细胞来源。[方法]采用密度梯度离心法分离出单个核细胞,细胞贴壁法在α-MEM培养基中获得原代hMSCs,随后进行传代培养。对成骨细胞分化采用碱性磷酸酶活性检测和Alizarin Red S染色进行鉴定；对脂肪细胞分化应用Oil Red-O染色方法进行鉴定；应用Alcian blue染色对软骨细胞分化进行鉴定。[结果]骨髓细胞培养6-24小时,胞体形状由圆形逐步变为三角型或不规则形状。培养第2-4天间充质细胞形态发生改变,细胞形态逐渐变为成纤维细胞样的梭型,并聚集成集落；培养7-14天,细胞长满培养瓶底面积的70%-80%,细胞排列更加紧密,此时的骨髓间充质干细胞为单层细胞。对细胞进行成脂诱导分化,可检测不同形状的Oil Red-O阳性染色细胞形成；成骨细胞诱导分化后,碱性磷酸酶活性检测,以及Alizarin Red S染色的阳性细胞形成；诱导成软骨细胞分化后可见Alcian blue染色阳性细胞形成。[结论]本试验采用的方法可以成功分离、培养及扩增人骨髓间充质干细胞,并鉴定其具有成骨、成脂、成软骨分化能力。第二部分DHEA上调IGF-I基因表达并促进hMSCs向成骨分化[目的]本研究验证DHEA是否通过调节IGF-I从而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。[方法]采用不同时间点、不同浓度DHEA药物刺激人骨髓间充质干细胞,进行时间和浓度依赖试验,并采用生物化学和小分子酶抑制剂去阐明DHEA在人骨髓间充质干细胞中调节IGF-I基因表达并促进其向成骨分化的机制。在本实验研究,应用PKA信号通路抑制剂H-89, PKC信号通路抑制剂CHE,JNK信号通路抑制剂SP600125分别阻断PKA信号通路,PKC信号通路,JNK信号通路。应用P13K信号通路抑制剂LY294002,P38 MAPK信号通路阻断剂SB203580,P42/44信号通路阻断剂PD098059, IGF-IR受体阻断剂AG1024分别阻断PI3K、P38 MAPK、P42/44 MAPK、IGF-IR信号通路。[结果]在骨髓间充质干细胞中,DHEA可上调IGF-I基因表达,并且存在时间和浓度依赖。IGF-I基因表达高峰期是在DHEA刺激后4-6小时；在刺激时间为6小时情况下,最佳药物浓度为10nM。阻断PI3K,P38 MAPK, P42/44 MAPK信号通路,DHEA上调IGF-1基因表达的作用被抑制。随后样本经特殊酶抑制剂作用后,对成骨分化相关基因和碱性磷酸酶检测均出现表达降低。[结论]DHEA可能经过IGF-I信号通路,包括PI3K, P38 MAPK, P42/44 MAPK信号通路来上调人骨髓间充质干细胞中IGF-I基因表达并促进其向成骨方向分化。第三部分[目的]研究老龄化与1 α-羟化酶关系,并阐明DHEA在维生素D代谢中的作用机制。[方法]运用RT-PCR方法研究在人骨髓间充质干细胞中维生素D代谢关键酶1α-羟化酶的表达,并切分析年龄对其表达的影响。应用IGF-IR受体阻断剂AG1024, CERB阻滞剂KG501分别阻断IGF-1, CERB信号通路,从蛋白水平研究DHEA在维生素D转化代谢中的作用机制。[结果]一组包括19例患者的样本中,年龄从40到87岁,平均年龄56±11岁,研究发现随着年龄的增长,CYP27B1/1α-羟化酶的表达逐渐下降。老年组(年龄>55岁,n=12)CYP27B1/1α-羟化酶表达是年轻组CYP27B1/1α-羟化酶表达(年龄<50岁,n=7)的64.4%。在老年组和年轻组中,我们通过RT-PCR分别对250HD3或1,25(OH)2D3±DHEA对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响进行研究。在年轻组中,成骨诱导培养3d后,我们发现25OHD3,1,25(OH)2D3, DHEA均可以促进成成骨相关标志基因的表达,如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和骨涎蛋白(bone sialoprotein, BSP)。但在老年组中,250HD3对相关成骨标志基因刺激作用较弱。在老年组中,经DHEA预处理后,250HD3和1,25(OH)2D3均可以诱导人骨髓基质干细胞向成骨方向分化。在人骨髓基质干细胞中,通过不同的小分子抑制剂的应用,发现cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)和[GF-I分别介导了脱氢表雄酮调节CYP27B1的作用。通过应用小分子抑制剂AG-1024(一种IGF-IR的抑制剂),发现脱氢表雄酮上调CYP27B1的表达都是通过IGF-I的激活。而通过应用小分子抑制剂KG-501(特殊抑CREB的下游基因),发现脱氢表雄酮上调CYP27B1的表达同样需要通过CREB的激活。由此推测CYP27B1上调则是由于DHEA激活的IGF-I信号系统,继发激活CREB所介导的。[结论]1α-羟化酶/CYP27B1的表达及活性随着人年龄的增长而下降。脱氢表雄酮可能上调IGF-I,从而激活CREB,最终上调CYP27B1,增强人骨髓间充质干细胞对于25OHD3的反应能力,从而增强其成骨分化能力。