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背景滤泡辅助性T细胞（follicular helper T cells，Tfh）及T辅助细胞9（T helper9cells，Th9）是最近新发现的两群不同于的Thl、Th2、Thl7及Treg等的CD4~~+T细胞亚群。Tfh重要的特征是膜表面表达CXC趋化因子受体5（CXC Chemokine Receptor5，CXCR5）、可诱导性共刺激因子（Inducible co-stimulator，ICOS），分别与B细胞吸附趋化因子-1（B cell attracting chemokine-1，BCA-1，也称为CXCL13）和可诱导性共刺激因子受体配体（Inducible co-stimulator ligand，ICOSL）结合，分泌细胞因子IL-21，Tfh被迁移至次级淋巴滤泡形成的生发中心（Germinal Center，GC），刺激GC处的初始B细胞活化为具有Ig分泌功能的浆细胞，进而辅助B细胞产生异常高亲和力抗体[1-4]。Th9的特征是可大量分泌IL-9，主要作用是使得炎症细胞的数量上升并分泌一些炎症介质，促进炎症的发生[5-7]。类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是以关节肿痛为主要表现的自身免疫性疾病，体内存在各种异常抗体及炎症因子，因此我们假设Tfh和Th9细胞可能参与RA发病机制，并通过检测RA患者外周血中Tfh和Th9细胞表达率，分析其与自身抗体、炎症细胞因子及临床表现等的关联性，探讨其与疾病的关系。目的本实验拟利用流式细胞仪检测RA患者和相匹配的正常对照组人群外周血中CD4~+CXCR5~+ICOS~+T (Tfh)及CD3~+CD8-IL9~+（Th9）占CD4~+T细胞的比例的差异及相关细胞因子（IL-21、CXCL13、IL-9）的变化，并分析Tfh和Th9细胞及IL-21、CXCL13、IL-9在RA中与病程、关节压痛数、肿胀数、疾病活动度（DAS28）、血沉、C反应蛋白、抗CCP抗体、RF、骨质侵蚀等临床及实验室指标的相关性，探讨Tfh、Th9在RA发病机制及病情进展中的作用及临床意义。方法于2011年1月至2011年4月收集77例RA患者，全部患者均符合1987ACR诊断标准[8]。同时选择51例年龄、性别相匹配的健康体检者作为正常对照。根据DAS28评分将77例RA患者分为轻度活动组（2.6<DAS28≤3.2，n=15）、中度活动组（3.2<DAS28≤5.1，n=31）、重度活动组（DAS28>5.1，n=31）；根据治疗情况将病人分为：未治疗组（8例），非正规治疗组（21例）及正规治疗组（48例）。利用流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测77例RA患者和51例正常对照的外周血单个核细胞（PBMCs）CD4-FITC，CXCR5-PE，ICOS-APC标记的Tfh比例；酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血浆中IL-21、CXCL13细胞因子水平，比较RA与正常对照之间的差异，分析Tfh及IL-21、CXCL13的水平与RA患者的关节压痛数、肿胀数、晨僵、病程、DAS28等临床指标以及ESR、CRP、抗CCP抗体、RF实验室指标、X线的骨侵蚀及治疗与否的相关性。于2011年5月至7月再次收集36例RA患者和22例年龄、性别相匹配的健康体检人群作为对照组，根据DAS28评分将RA患者分为重度活动组（DAS28>5.1，n=22）、中度活动组（3.2<DAS28≤5.1，n=14）。流式细胞术检测研究对象PBMCs的CD3-APC,CD8-FITC,IL9-PE标记的Th9比例；ELISA检测IL-9的水平，比较其变化，并分析与临床及实验室指标的相关性。结果1. RA患者外周血中Tfh的百分率及细胞因子水平明显升高：RA患者外周血中Tfh的百分率明显高于正常对照（2.99±1.24VS1.07±0.42， P<0.001）；RA患者血浆中IL-21（1.668±0.392VS1.264±0.374）及CXCL13（1.499±0.470VS0.999±0.165）的水平明显高于正常对照，P均<0.001。2. RA患者外周血中Th9表达率高于正常对照（0.989±0.498VS0.213±0.084，P=0.000）。RA患者的IL-9水平明显高于正常对照（1.055±0.421VS0.686±0.134，p<0.01）。3. Tfh及IL-21、CXCL13的水平与RA患者活动性相关： RA患者轻度，中度，重度活动组的Tfh百分率分别为（1.85±0.66、2.46±0.64、4.02±1.16）均明显高于正常对照（1.07±0.42），P均<0.001；三组活动组相比，F=8.075，P<0.001。轻、中、重度RA患者血浆中IL-21水平依次为（1.435±0.303vs1.638±0.330vs1.908±0.415）均高于正常对照（1.319±0.399），P均<0.05；三组度活动组相比，F=6.125，P<0.001。轻、中、重度组RA患者血浆中CXCL13水平依次为（1.179±0.245vs1.434±0.431vs1.756±0.527）亦高于正常对照（0.999±0.165）,P均<0.05，三组活动组相比，F=5.364，P<0.001。3.RA患者中度、重度的Th9百分率分别为（0.686±0.254vs1.181±0.523），均明显高于正常对照组（0.686±0.254），P均<0.001；重度活动组明显高于中度活动组（P<0.001）。中、重度活动组RAIL-9表达率（0.939±0.301vs1.367±0.470），均明显高于正常对照（0.686±0.134），P均<0.001，重度活动组亦明显高于中度活动组（P<0.001）。4.RA中有严重骨质破坏的患者（3.36±1.28）其Tfh表达率明显高于无或轻度骨质破坏者（2.67±1.11），P<0.05。5.Tfh细胞数与RA患者DAS28(r=0.352, p=0.002)、ESR(r=0.230,p=0.004)、关节压痛数(r=0.269,p=0.018)、骨质破坏（r=0.306,P=0.007）、RF(r=0.622,p=0.000)及抗CCP滴度(r=0.283,p=0.026)呈正相关；而与IL-21(r=0.367,p=0.001)，CXCL13(r=0.283,p=0.026)亦呈正相关；与病程、晨僵、关节肿胀数无相关性。而血浆中IL-21与DAS28(r=0.469,p=0.000),ESR(r=0.387,p=0.002),RF(r=0.306,p=0.0015),关节压痛数(r=0.344,p=0.006)及CXCL13(r=0.435,p=0.000)亦呈正相关。同时血浆中CXCL13与DAS28(r=0.415,p=0.001),ESR(r=0.410,p=0.001),CRP(r=0.353,p=0.005),关节压痛数(r=0.252,p=0.046)呈正相关。6.Th9的表达水平与患者的关节压痛数(r=0.341,p=0.042)、关节肿胀数(r=0.347,p=0.038)、ESR(r=0.347,p=0.042)、CRP(r=0.384,p=0.021)、DAS28(r=0.461,p=0.005)及RF(r=0.379,p=0.025)呈正相关。而与病程、晨僵、抗CCP以及骨质破坏程度无相关性（P>0.05），RA患者IL-9的水平与患者的关节压痛数(r=0.420,p=0.023)、关节肿胀数(r=0.361,p=0.035)、ESR(r=0.403,p=0.018)及DAS28(r=0.385,p=0.048)呈正相关,而与病程、晨僵、CRP、抗CCP、RF以及骨质破坏无相关性（P>0.05）。7.未治疗组，非正规治疗组、正规治疗组的Tfh表达率呈逐渐降低(3.43±1.26vs2.83±1.26vs2.73±0.85，P均<0.001)，且均高于正常对照组。结论1.RA患者外周血Tfh及IL-21、CXCL13的水平明显高与健康对照组；且Tfh表达率随着病情活动度的增加而增高，其水平与DAS28评分、关节压痛数、血沉、CRP及骨质侵蚀呈正相关，说明Tfh细胞可能参与RA发病，并影响病情活动及骨破坏。2.Tfh表达率与RA患者抗CCP抗体、RF等RA较特异的自身抗体呈正相关，进一步证实了Tfh可以辅助B细胞产生异常高亲和力抗体的这一功能。3.经治疗后，RA外周血Tfh表达率明显低于未治疗者，说明可通过监测Tfh表达率来了解RA患者治疗效果。4. Th9及IL-9较正常对照明显升高，且Th9的表达率与患者的DAS28、关节压痛数、血沉、CRP等炎症指标呈正相关，说明Th9与疾病的炎症有关，可能是促进患者体内炎症发生发展的靶点之一。