选题依据:远志皂苷作为远志药材中重要的次生代谢产物之一,属于齐墩果烷型五环三萜类化合物,具有安神益智、镇静祛痰、抗抑郁、抗衰老、抗老年痴呆等药理作用。远志皂苷药理活性的多样性使其特别适合开发成为具有抗衰老和脑保护作用新药的先导化合物,但其从药材中的提取率极低,且尚未建立人工合成方法,这已严重制约了相关药物的开发。因此阐明远志皂苷生物合成途径,将对于在体外生物合成大量远志皂苷具有重要意义。本课题组前期研究已证明远志皂苷生物合成上游是通过甲羟戊酸(MVA)途径完成的,中游的鲨烯合成酶(SQS)和角鲨烯环氧酶(SQE)与下游合成远志皂苷的前体的β-香树脂合酶(β-AS)密切相关,但后期还需经过植物细胞色素单加氧酶P450(CYP450s)与糖基转移酶(UGTs)的修饰生成远志皂苷。由于CYP450s、UGTs是较大的酶家族,所以目前远志皂苷下游途径仍不清晰,因此筛选远志皂苷下游途径中的CYP450s、UGTs酶基因是阐明远志皂苷整条生物合成途径的关键所在。目前,已有研究证明远志对于帕金森病(PD)有一定的治疗作用,但上述对远志抗PD的研究是基于动物体内及细胞水平上,具有造模周期长、影响因素多、经济成本高等缺点,并且缺少在蛋白水平上的相关研究。因此,建立一种体外多巴脱羧酶(hDDC)特异抑制剂的筛选模型将有助于远志抗PD药理作用的深入研究。目的:1.获得远志根与叶的转录组数据,进一步丰富远志基因资源,筛选远志皂苷的生物合成下游途径中关键酶基因—CYP450s与UGTs。2.复制并建立一种体外hDDC特异抑制剂的筛选模型,用于探讨远志的抗PD的药理作用。方法:1.应用数字基因表达谱(DGE)测序技术分别对远志皂苷含量差异较大的根与叶组织,平行三次进行测序,得到远志根与叶中的差异表达基因,筛选出远志根中上调的酶基因。2.基于远志根与叶的DGE数据,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对涉及远志三萜皂苷生物合成途径的22条基因(17条CYP450s与5条UGTs)在远志根与叶中表达水平进行分析,通过相关性分析得到参与远志皂苷生物合成下游途径的关键CYP450s和UGTs酶基因。3.采用hDDC与PEPC联合酶活测定体系建立hDDC特异抑制剂的筛选模型,对远志的不同提取物(95%乙醇提取物与水提物)和不同萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、氯仿部位、正丁醇部位、萃取水部位)进行了初步活性筛选。结果:1.本研究通过远志根与叶平行三次的DGE测序,分别得到了远志根与叶的转录组数据库。远志根与叶中分别得到高质量Reads数目为60,437,865与61,926,272,通过拼接共得到 494,113 条 contigs、298,586 条 transcripts、64,171 条unigene,对前期远志的测序数据进行了补充和完善。2.构建了远志根与叶的DGE数据库,远志根与叶三次测序平行性较好,远志根与叶中差异表达的Unigene共6943条,占总数的10.88%;根中上调的差异表达基因通过KEGG注释到三萜皂苷生物合成途径中的分别是PMK、FPPS和β-AS;筛选出参与远志皂苷合成下游途径的共有22个酶基因(17条CYP450s与5条UGTs)。3.基于远志根与叶的DGE数据,采用RT-qPCR法对远志皂苷生物合成途径涉及的22条基因在远志根与叶中的表达水平进行分析,并结合相关性分析进一步筛选出 6 个酶基因,CYP71A1、CYP94A2、CYP714C2、CYP78A9、CYP734A6(CYP734A1)、UGT73C4与远志皂苷生物合成下游途径紧密相关,DGE测序结合RT-qPCR技术可以有效的筛选远志皂苷生物合成途径中的关键酶基因以及发现新基因。4.通过复制并建立hDDC特异抑制剂的筛选模型,对远志的不同提取物和不同萃取部位进行了初步活性筛选,结果发现远志氯仿萃取部位对hDDC表现出一定的抑制作用,提示上述提取物与萃取部位可能具有抗PD的作用,体外hDDC特异抑制剂的筛选模型可以用于后续的高通量活性筛选。结论:CYP71A1、CYP94A2、CYP714C2、CYP78A9、CYP734A6(CYP734A1)和UGT73C4与远志皂苷生物合成下游途径紧密相关,这对远志皂苷生物合成途径的阐明提供了科学依据。此外,通过体外hDDC特异抑制剂的筛选模型得到远志氯仿萃取部位可能具有抗PD的作用,这不仅为上述部位中有效化学成分的分离及结构鉴定奠定了科学基础,也为远志发挥抗PD的药理作用及机制的研究提供了一种新思路。