【摘 要】
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γ-癸内酯广泛用于各类日化香精,有良好定香作用。目前,利用微生物法生产γ-癸内酯的微生物主要为酵母菌。酵母菌一般选用解脂酵母（Yarrowia sp.）、假丝酵母（Candida sp.）、毕赤酵母（Pichia sp.）、锁掷胞酵母（Sporidiobolus sp.）等菌株。其中解脂酵母生成γ-癸内酯的能力尤为显著。γ-癸内酯的产生过程是以蓖麻油中的主要组分蓖麻油酸为底物,先经过β-氧化使碳链
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γ-癸内酯广泛用于各类日化香精,有良好定香作用。目前,利用微生物法生产γ-癸内酯的微生物主要为酵母菌。酵母菌一般选用解脂酵母（Yarrowia sp.）、假丝酵母（Candida sp.）、毕赤酵母（Pichia sp.）、锁掷胞酵母（Sporidiobolus sp.）等菌株。其中解脂酵母生成γ-癸内酯的能力尤为显著。γ-癸内酯的产生过程是以蓖麻油中的主要组分蓖麻油酸为底物,先经过β-氧化使碳链缩短,再内酯化生成γ-癸内酯。这个β-氧化过程到产生γ-癸内酯涉及编码乙酰辅酶A氧化酶的pox1-pox6这6个基因。乙酰辅酶A氧化酶具有催化γ-癸内酯分解的生物学功能,可降低酵母细胞γ-癸内酯的产率。本课题通过敲除解脂酵母的pox基因,研究其对γ-癸内酯产量的影响。本课题分别设计含有与解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）编码短链特异乙酰辅酶A氧化酶的pox4基因和pox6基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒pUG6为模板进行PCR构建带有Cre/loxP系统的敲除组件。转化解脂耶罗维亚酵母（Yarrowia lipolytica）,并将质粒pSH65转入阳性克隆子。半乳糖诱导表达Cre酶切除Kan基因,在YPD培养基中连续传代培养丢失pSH65质粒,在原ORF处留下一个loxP位点,最终分别获得pox4基因和pox6基因缺陷型菌株。气相色谱实验测定pox4和pox6基因敲除菌的γ-癸内酯产量并没有得到提高。但是发酵副产物3-羟基癸内酯和6—羟基—3—十二碳烯酸产量增加了。6—羟基—3—十二碳烯酸是发酵γ-癸内酯的原料,通过向发酵液加入还原酶,还原双键,接着β-氧化除去两个碳原子,最后羧基和羟基环化得到我们所需的γ-癸内酯。
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