论文部分内容阅读
目的 1.通过观察呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺腺癌上皮细胞(A549细胞)后6h、12h、24h三个不同时间点PPARγ、IL-17及人钙激活氯离子通道辅助蛋白1(hCLCA1) mRNA和蛋白表达的变化，探讨RSV感染气道黏液高分泌中分子机制。 2.观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮和PPARγ阻滞剂(GW9662)和IL-17抗体干预对RSV感染A549细胞PPARγ、IL-17及hCLCA1mRNA及蛋白表达的影响，探讨罗格列酮在RSV感染气道黏液高分泌中的抑制效应。 方法 1.建立RSV感染的体外细胞模型，将A549细胞传代培养，待细胞生长至80％左右时，传代于六孔板中，随机分成6组:A组（罗格列酮+RSV组）、B组（罗格列酮+GW9662+RSV组）、C组（RSV组）、D组（IL-17抗体+RSV组）、E组（GW9662+RSV组）、F组（细胞+0.02％DMSO对照组）。D组在RSV感染造模2小时前加入IL-17抗体。A-E组以100TCID50 RSV感染吸附2h后加维持液继续培养。造模开始前A组予罗格列酮（10μ mol/L）预处理0.5h，B组在罗格列酮干预前先以GW9662（10μ mol/L）预处理0.5h，各组均培养6h、12h、24h收获细胞及上清液待测。 2.实时荧光定量RT-PCR检测不同时间点各组PPARγ、IL-17、hCLCA1 mRNA表达，Western Blot方法检测hCLCA1蛋白水平，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清液中IL-17蛋白表达。 结果 1.病毒滴度测定:实验RSV的TCID50为10-4.4/50μ l。实验的病毒攻击量为100TCID50。即10-2.4/50μl。 2.罗格列酮、GW9662及0.02％DMSO的细胞毒性:10μ mol/L罗格列酮、10μmol/L GW9662和0.02％DMSO处理后三个时间点(6h、12h、24h) A549细胞存活率分别89.19％、96.61％、94.45％;91.73％、95.70％、90.21％和90.06％、96.43％、.91.85％。与细胞对照组相比差异无统计学意义（均P＞0.05），表明上述浓度的药物对A549细胞无毒性作用。 RSV感染及罗格列酮、GW9662、IL-17抗体干预后PPARγmRNA表达变化: F组PPARγ仅少量表达，与F组相比，A组、B组、C组、D组、E组PPARγmRNA表达量均有增加（均P＜0.05），且随时间增加，PPARγmRNA表达量增加。A、B、C、D、E组PPARγmRNA表达量均在感染后24h达高峰，A、C、E组差异有统计学意义（均P＜0.05），B组、D组12h与24h表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。三个时间点A组PPARγ mRNA表达量均明显高于C组，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。B组、D组、E组与C组相比，同一时间点上PPARγ mRNA表达量相近，差异无统计学意义。 4.RSV感染后IL-17、hCLCA1mRNA和蛋白水平表达变化:与F组相比，C组IL-17、hCLCA1mRNA和蛋白表达在三个时间点均明显升高（均P＜0.05），且随时间增加，表达量增加，24h表达量达高峰，与12h比较差异有显著统计学意义（均P＜0.05）。 5.罗格列酮、GW9662及IL-17抗体干预对IL-17、hCLCA1mRNA和蛋白水平的影响:在同一时间点上A组、D组IL-17、hCLCA1mRNA和蛋白均低于C组，差异有显著统计学意义（均P＜0.05），但明显高于F组，差异亦有显著统计学意义（均P＜0.05），B组、E组与C组相比，各时间点IL-17、hCLCA1mRNA和蛋白表达量相近，差异无统计学意义(P＞0.05)，但仍高于F组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。与B组相比，A组IL-17、hCLCA1mRNA和蛋白表达均明显降低(P＜0.05)。罗格列酮及IL-17抗体对IL-17mRNA和蛋白的抑制作用在干预后6h最强，与12h、24h相比，差异有显著统计学意义(P＜0.05)。罗格列酮及IL-17抗体对hCLCA1mRNA和蛋白的抑制作用在干预后12h最强，但与6h、24h相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。 结论 1.RSV感染A549细胞后hCLCA1mRNA及蛋白表达增加，表明RSV感染可引起黏液高分泌，同时PPARγ及IL-17mRNA表达增加，表明PPARγ及IL-17参与RSV感染后气道黏液高分泌过程。 2.IL-17抗体干预可明显降低RSV感染后IL-17、hCLCA1的表达，表明RSV感染可通过上调IL-17表达增加气道黏液分泌。 3.罗格列酮干预可促使RSV感染后PPARγ表达量增加，同时抑制IL-17、hCLCA1 mRNA及蛋白表达的增加，而使用GW9662后可拮抗罗格列酮的作用，表明罗格列酮可上调PPARγ基因的表达，使PPARγ活性增强，在转录水平下调IL-17表达，从而抑制气道黏液高分泌。