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目的:三氧化二砷(Arsenic trioxide,ATO)可以激活TGFβ/Smad信号通路引起HSCs活化,并且ATO对PML类泛素化也有调控作用。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)可调节TGFβ/Smad信号通路拮抗砷诱导的肝纤维化。但目前PML类泛素化是否在ATO诱导的HSCs活化中发挥作用以及原花青素是否调控PML类泛素化激活TGFβ/Smad信号通路未见报道。因此本研究用ATO和GSPE对HSCs进行干预,验证ATO是否通过PML类泛素化修饰诱导HSCs活化,为砷引起的肝纤维化的防治提供策略;探讨原花青素是否通过调控PML类泛素化修饰拮抗ATO诱导的肝纤维化,为完善GSPE的作用机制提供理论依据。方法:本研究采用HSCs作为实验对象,利用ATO(2μmol/L),GSPE(50 mg/L),PML小干扰RNA(PML siRNA),UBC9 小干扰 RNA(UBC9 siRNA)以及 RNF4 小干扰 RNA(RNF4 siRNA)干预细胞,CCK-8分析细胞活性;Western Blot测定PML类泛素化修饰指标(S-PML、PML、SUMO-1、SUMO-2/3)、TGFβ/Smad信号通路、HSCs活化指标(α-SMA、Collagen Ⅰ)以及炎症指标(IL-1β、TNF-α)的表达情况;免疫荧光染色检测PML-NBs形成情况;qRT-PCR检测TGF-β1、α-SMA和Collagen I mRNA的表达情况。采用one-way ANOVA方法比较多组间的差异,组间多重比较采用Bonferroni法,析因设计方差分析分析ATO与GSPE间的交互作用,P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1.ATO与GSPE对HSCs活性的影响 不同浓度ATO和GSPE干预实验中,2、3和5 μmol/L的ATO干预HSCs,细胞活性升高(P<0.05);与对照组相比,25 mg/L和50 mg/LGSPE干预细胞24h后,细胞活性无明显变化(P>0.05);50 mg/LGSPE能降低ATO诱导的HSCs活性(P<0.05)。2.ATO 和 GSPE 对 HSCs 炎症指标的影响 ATO 干预组 IL-1β(0.45±0.01)和 TNF-α(0.35±0.02)的水平显著高于对照组;25 mg/L和50 mg/L的GSPE均会抑制ATO诱导的IL-1β和TNF-α蛋白的表达水平(P<0.05)。3.ATO和GSPE对HSCs活化指标的影响ATO干预组α-SMA和Collagen Ⅰ蛋白质的表达均高于对照组(P<0.05);50mg/LGSPE会下调ATO诱导的α-SMA蛋白的表达水平(P<0.05)。4.ATO和GSPE对TGFβ/Smad信号通路的影响 2 μmol/L的ATO处理HSCs会升高TGF-β1(0.51±0.04)和p-Smad2/3(0.28±0.03)蛋白的表达(P<0.05);施加GSPE干预会下调ATO所诱导的 TGF-β1(0.24±0.01)和 p-Smad2/3(0.18±0.02)蛋白的表达(P<0.05)。5.ATO和GSPE对PML类泛素化的影响 2 μmol/L ATO处理4h和3μmol/L ATO处理2/4h均会升高类泛素化相关蛋白的表达水平(P<0.05);ATO处理细胞24h后不会刺激PML类泛素化修饰(P>0.05);GSPE处理组PML类泛素化相关蛋白的表达无明显改变(P>0.05);50 mg/LGSPE处理组会下调 ATO 诱导的 S-PML(0.27±0.03)、PML(0.18±0.01)、SUMO-1(0.37±0.02)和 SUMO-2/3(0.40±0.02)蛋白的表达水平(P<0.05)。6.分别沉默PML、UBC9和RNF4后ATO和GSPE对PML类泛素化修饰的影响 与未转染组比较,PML转染组PML类泛素化相关蛋白的表达明显降低(P<0.05);在PML转染基础上施加GSPE 干预会降低 ATO 诱导的 S-PML(0.25±0.02)、PML(0.36±0.02)、SUMO-1(0.46±0.02)和SUMO-2/3(0.48±0.03)蛋白的表达水平(P<0.05)。沉默UBC9后,PML类泛素化相关蛋白的表达均下调(P<0.05);而沉默RNF4后S-PML、PML、SUMO-1以及SUMO-2/3蛋白的表达明显升高(P<0.05);在转染UBC9或RNF4的基础上,施加GSPE干预均会明显下调ATO诱导的S-PML、PML、SUMO-1 及 SUMO-2/3 蛋白的表达水平(P<0.05)。7.分别沉默PML、UBC9和RNF4后ATO和GSPE对HSCs活化指标的影响 与未转染组相比,PML转染组会减少HSCs活化指标TGF-β1、α-SMA和Collagen I蛋白的表达水平(P<0.05);沉默 PML 后,GSPE 会下调 ATO 诱导 TGF-β1(0.69±0.03),α-SMA(0.73±0.03)和 Collagen I(0.48±0.02)蛋白的表达(P<0.05)。沉默 UBC9 后会下调 ATO 诱导的 TGF-[31、p-Smad2/3、α-SMA 和 Collagen content mRNA和蛋白质的表达水平(PP<0.05),沉默RNF4会加重ATO诱导的HSCs活化指标的表达(P<0.05);在转染UBC9或RNF4的基础上,施加GSPE均会下调ATO诱导的TGF-β1和α-SMA蛋白的表达(P<0.05)。结论:ATO可以通过刺激PML类泛素化修饰诱导HSCs活化,引起肝纤维化。GSPE可能通过抑制炎症因子IL-1β和TNF-α的表达,拮抗ATO诱导的肝脏炎症损伤;GSPE还可能通过抑制PML类泛素化过程,下调TGFβ/Smad信号通路,拮抗ATO诱导的HSCs活化。