论文部分内容阅读
趋磁细菌磁小体以其独特的结构和新奇的性质,得到了广大科研工作者的青睐,成为近十几年来化学、物理学、材料学和生物学研究的热点之一。本文以趋磁细菌AMB-1及其磁小体为研究对象,着眼于其修饰后的主动靶向性和水溶性衍生物在生物领域的应用之一——高效磁共振成像(MRI)造影剂,制备了新型的具有潜在细胞靶向性检测功能的磁共振成像造影剂,研究了其水质子弛豫效率和稳定性,取得了一系列有意义的结果。目的:1.制备出纳米级生物材料聚乙二醇(PEG)包裹的主动靶向线粒体细胞色素c的磁小体,PEG-cBMP;2.体外检测PEG-cBMP在三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的主动靶向性及其MR成像检测。材料与方法:1.大量培养趋磁细菌AMB-1菌株,通过(高分辨力)透射电子显微镜(TEM)及能谱电镜验证其体内是否存在磁小体及其成分检测;进一步通过离心、细菌破碎、反复洗涤、磁铁吸附等方法逐步提取、纯化磁小体并做X—射线衍射(XRD)、能谱仪(EDS)、傅里叶红外变换光谱(FT-IR)、磁滞回线(hysteresis loop)、zeta电位、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、透射电子显微镜(TEM)、原子吸收光谱(AAS)等方法对其纳米结构及理化性质进行表征;2.将可以主动靶向线粒体且带有荧光物质Alexa Flour647的细胞色素c引物与磁小体(BMP)通过自组装法结合,制备出复合物Cyt c-BMP (cBMP)并进行表征;3.通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂交联的方法将两端分别修饰甲氧基、羧基且分子量为2000Da的PEG,即M-PEG-COOH2000与c-BMP连接,制备出具有更好生物相容性、长效性的PEG-cBMP,并进行表征;4.将制备出的PEG-cBMP与三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231共同孵育,再分别转染针对线粒体和细胞核的荧光试剂——Mito-tracker green和Hochest33342,通过激光共聚焦显微镜及透射电子显微镜检测PEG-cBMP的主动靶向性并做MR成像;并检测PEG-cBMP对水质子的弛豫效率及成像效果。统计学方法:采用统计软件SPSS13.0做4×6析因设计的方差分析统计学处理,分析不同药物浓度与不同时间点下对MDA-MB-231细胞株增殖的影响。PEG-cBMP浓度与MDA-MB-231细胞株信号之间的关系做线性回归(Linear Regression)分析,得到R2弛豫率。结果:1.通过透射电子显微镜、能谱仪、傅里叶红外变换光谱、磁滞回线、zeta电位、电感耦合等离子体质谱及X—线衍射等上述一系列表征方法证明,我们已经成功制备出PEG-cBMP;2.与三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231共同孵育,通过CCK8法检测细胞增殖能力的影响中,采用统计软件SPSS13.0,行4×6析因设计的方差分析,得出(1)CCK8法检测标记不同药物浓度PEG-cBMP颗粒对MDA-MB-231细胞增殖的影响差异有统计学意义(F=14.855,P<0.001);(2)不同时间点PEG-cBMP颗粒对MDA-MB-231细胞增殖的影响差异有统计学意义(F=280.546,P<0.001);(3)不同药物浓度PEG-cBMP颗粒与不同时间点对MDA-MB-231细胞增殖影响有交互效应(F=2.195,P=0.020)。(4)且在PEG-cBMP浓度不变时,各组浓度均会随时间的延长对MDA-MB-231细胞增殖差异统计学意义,见表3-2,(统计量与P值分别为F=30.618, P<0.001; F=130.050, P<0.001; F=244.281, P<0.001; F=667.396, P<0.001; F=174.135, P<0.001;).表明本研究中的PEG-cBMP的[Fe]在一定范围内对细胞增殖有一定的影响。而通过激光共聚焦显微镜、透射电子显微镜等检测,进一步证明PEG-cBMP具有主动靶向线粒体的作用;3.将转染了PEG-cBMP的细胞株MDA-MB-231进行MR成像,PEG-cBMP中[Fe]的浓度与MDA-MB-231细胞信号之间的线性回归(Linear Regression)方程为1/T2=-0.024+1062.264X (R2=0.906, F=28.935, P=0.013),其中X是Fe的浓度。可见随着PEG-cBMP浓度的提高,细胞信号随之下降,因T2弛豫率定义为含铁浓度与1/T2直线方程的斜率,故可得PEG-cBMP的R2驰豫率为1062.264(mmol-1·L·s-1).表明PEG-cBMP确实是一种高效的MRI造影剂。结论:这种由趋磁细菌体内提取的生物源性纳米材料再经过连接引物及修饰PEG后最终得到的PEG-cBMP是一种具有良好生物相容性、主动靶向线粒体的优良T2磁共振对比剂。