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1.研究目的以后肢缺血大鼠为模型,比较血府逐瘀汤治疗组和对照组之间早期缺血损伤的病理变化和血管新生差异,通过基因芯片技术分析血府逐瘀汤关键的作用靶点和整体作用规律。2.方法2.1采用白芨微球栓塞剂制作大鼠后肢缺血模型,给予不同剂量的血府逐瘀胶囊水溶剂灌胃,造模后第3天造模肢体给予低位截肢。截肢术后第36小时、48小时及72小时分别取材缺血坏死部位组织,苏木精-伊红染色后在低倍镜下观察组织修复状态。挑选修复状况较好组别的肉芽组织在高倍镜下观察并随机选取6个视野计数局部肉芽组织血管数量,选取最佳时间点最佳组别的肉芽组织进行芯片检测。2.2利用基因芯片技术对最佳药物组肉芽组织进行差异表达基因、GO功能分类、Pathway等分析。2.3利用实时定量PCR技术对芯片部分结果进行验证。3.结果3.1常规病理切片低倍镜下观发现截肢后36小时和48小时均表现为肉芽组织,36小时肉芽组织较为新鲜,48小时有纤维化趋势,但与36小时比较没有明显界限,随着时间延长至72小时,肉芽组织逐渐纤维化形成瘢痕组织。故选取36小时和48小时血管计数,结果36小时各组间比较有统计意义,高剂量药物组与常规剂量组和生理盐水组比较P值均小于0.001,常规剂量组与生理盐水组比较P值小于0.05；48小时各组间比较无统计意义(P值大于0.05)。36小时高剂量组血管数量最多,故选取36小时高剂量血府逐瘀汤组肉芽组织,与生理盐水组对照进行芯片检测。3.2通过芯片技术分析并筛选到2080个差异表达基因,其中860个上调,1225个下调；通过GO功能分类得到4条与血管新生有关的BP条目,分别是血管新生、血管新生的调控、血管新生的积极调控、VEGF受体信号通路的积极调控(P值均小于0.05),此4条条目下富集了VEGFb等25个与血管新生直接相关的差异表达基因；通过Pathway分析共得到49条有显著性差异(P值均小于0.05)的通路,其中11条与血管生成相关,具体为细胞外基质受体相互作用、细胞粘附分子通路、Hippo和Hedgehog信号通路、TGF-β6条通路上调,Chemokine通路、细胞因子-细胞因子受体间的相互作用、Hifl信号通路、Toll-like受体、Jak-STAT5条信号通路下调。3.3Real-time PCR验证结果主要因子VEGF b、TGFβr2、K1f5及Cyr61与生理盐水组比较差异倍数均大于2,其中与对照组比较高剂量药物组上调了VEGF b、TGFβr2、K1f5的表达,下调了因子Cyr61。Real-time PCR与芯片结果基本相符。4.结论4.1高剂量组血府逐瘀汤在短时间内较常规剂量组、对照组能更好的促进大鼠后肢缺血坏死模型肉芽组织的血管生成。4.2血府逐瘀汤促血管新生是一个复杂的调控过程,本实验通过基因芯片技术得到4条直接与血管新生有关的BP条目及富集在这些条目下的25个关键基因,11条与血管新生过程相关的通路,进一步证实血府逐瘀汤对血管新生的调控为多基因、多靶点、多通路的过程。4.3Real-time PCR对关键基因的验证与芯片结果基本相符,说明利用芯片技术所得到的药物调控机制的相对准确性。