亲和层析介质的制备及其对家蝇GABA受体的分离纯化

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γ-氨基丁酸(aminobutyric acid,GABA)受体是杀虫剂的重要作用靶标。它的结构与相关农药毒理和抗药性密切相关。因此,分离纯化GABA受体,并研究其立体结构,对于开发高效、低毒、安全农药和克服害虫的抗药性具有重要的指导意义。本文以家蝇为研究对象,研究了GABA受体的亲和分离方法。通过文献调研,总结了GABA受体的分离纯化方法,分析了去污剂对受体分离效率的影响规律,并利用计算化学的方法,从文献报道的小分子中,确定亲和层析的配体为Ro7-1986/1。通过基质活化、偶联和封闭等过程制备了亲和层析介质,并确定了该亲和层析柱的应用条件。基质活化:选择Sepharose6B作为亲和层析基质,1,4-丁二醇二缩水甘油醚为活化剂,直接连接在基质上。所得活化的Sepharose6B上含有的环氧基密度为65.27μmol/g胶。研究了活化温度、时间及pH等条件对活化效率的影响。最终确定了1,4丁二醇而缩水甘油醚活化Sepharose6B的最佳实验条件为:5.0gSepharose6B、5.0mL0.3mol/L的NaOH溶液和10mg NaBH4混合,再加入5mL1,4-丁二醇二缩水甘油醚和5.0mL DMSO,35℃条件下170rpm振荡8h。偶联与封闭:活化的Sepharose6B上的环氧基与Ro7-1986/1末端的伯氨基反应,将Ro7-1986/1固定在Sepharose6B上,再用1mol/L乙醇胺溶液封闭残余环氧基,最终Ro7-1986/1的偶联度为62.09μmol/g胶。亲和层析柱分离:将制备好的亲和层析介质Ro7-1986/1-Sepharose6B装柱,分离纯化家蝇脑组织内的GABA受体。通过亲和层析和离子交换层析,目的蛋白质浓度为7.3μg/mL,总量为182.5μg。凝胶电泳分析得到了分子量分别为45kD、50kD和80kD左右的三条条带,可能为家蝇GABA受体的α、β和γ亚基,与文献报道的其他生物的对应亚基相近。本文的创新点在于利用亲和层析方法从家蝇脑组织中得到了GABA受体,并鉴定了各个亚基的分子量。
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