论文部分内容阅读
米曲霉因具有强大的胞外蛋白分泌能力而被广泛应用于蛋白表达研究,但与同源蛋白相比,异源蛋白的产量却很低。主要原因是在米曲霉中异源蛋白不能进行有效的加工、转运、分类和分泌,导致非折叠蛋白在内质网累积。当蛋白的折叠需求超过内质网的加工能力就会诱导激活非折叠蛋白反馈调节机制(UPR)来缓解内质网压力。UPR的激活主要依赖于内质网转膜激酶/内切核糖核酸酶IRE1和亮氨酸拉链转录因子HacA组成的信号级联放大过程。目前米曲霉UPR的研究常通过添加刺激性化学物质、过量表达异源或同源蛋白以及改变培养条件等方式诱导激活,但由于尚未成功构建UPR关键转录因子HacA的相关功能菌株,因此在米曲霉UPR机制中HacA对蛋白分泌途径基因的调控作用仍无法得到准确评估,这是本论文研究的科学问题之一。在丝状真菌中除了UPR,还存在另外一个被称为分泌压力应答抑制(RESS)的保护机制,通过抑制分泌蛋白基因的转录来缓解内质网压力,目前的研究推导认为RESS是通过分泌蛋白基因的启动子介导,但这些启动子上介导RESS的顺式成分(序列)仍不明确,这也是本论文研究的另一个科学问题。本论文将通过构建HacA缺失和组成型激活突变菌并结合全基因组转录测序,全面的表征HacA在分泌途径和整个细胞代谢过程中的调控作用;同时以米曲霉的淀粉酶为模式基因详细分析参与RESS激活的关键顺式序列。具体研究内容如下:(1)米曲霉高效同源重组遗传操作系统的构建与应用研究通过敲除米曲霉niaD300中非同源末端连接(NHEJ)途径中的关键基因ku70,减少了非同源事件,获得高效同源重组菌(niaD-;ku70::ptrA);并以此为基础,利用同源整合敲除pyrG基因作为双向筛选标记(niaD-;△pyrG;ku70::ptrA),以及敲除蛋白酶调控基因prtT构建蛋白缺失的表达宿主(niaD-;△prtT;△pyrG;ku70::ptrA),同时转录和胞外蛋白分析结果显示敲除prtT能够抑制蛋白酶表达。(2)UPR缺失与组成型激活突变菌的构建及其生长表型和蛋白分泌研究基于已构建的高效同源重组的宿主菌(niaD-;△pyrG;ku70::ptrA),利用同源重组技术成功构建了UPR缺失突变菌(HacA-DE,HacA-DE-RE)和不同启动子调控的UPR组成型激活突变菌(HA(HacA-CA),HAGFP,HALGFP,HA-gpdA,HAGFP-gpdA,HALGFP-gpdA,HA-amyB,HAGFP-amyB和HALGFP-amyB)。通过对获得的UPR缺失突变菌和不同类型UPR组成型激活突变菌的生长表型和胞外分泌蛋白分析显示,在菌体正常生长过程中UPR机制关键转录因子HacA的表达必须保持一定的阈值水平,过高或者过低都会对菌体产生有害的影响,如抑制菌体生长和胞外蛋白的分泌。(3)UPR关键转录因子HacA敲除菌与组成型表达菌的转录组水平差异研究采用RNA-seq技术对UPR缺失突变菌HacA-DE和组成型激活突变菌(HacA-CA)进行转录组测序,获得了米曲霉的全基因组水平转录图谱。基于转录组数据分析发现,UPR的缺失和组成型激活导致差异基因主要聚类在蛋白分泌途径、氨基酸代谢、脂类代谢和糖代谢四个方面,这说明UPR在这些途径调控中发挥着重要的作用。为了进一步了解UPR的缺失和组成型激活对分泌途径的影响,将获得的HacA-CA和HacA-DE转录组差异表达基因与已知的369个分泌途径相关基因进行映射分析,结果显示以niaD300和HacA-DE为参照,HacA-CA中共有80个基因出现差异表达;以niaD300为参照,HacA-DE中有36个基因出现差异表达;同时对上述的80和36个差异基因进行归类分析,发现这些差异基因主要参与蛋白折叠/UPR、糖基化、囊泡运输等过程。同时我们还发现HacA-CA和HacA-DE突变菌中参与糖代谢作用基因的转录水平大部分出现共同下调,特别是淀粉水解酶类基因,这个结果说明在UPR的缺失和组成型激活条件下,RESS均参与了内质网压力的调控。另外,我们将米曲霉UPR组成型激活、DTT胁迫和amyB过量表达条件下的六组转录组数据进行比较表达差异分析,结果显示有28个基因的转录共同出现显著的差异表达,作者认为这些可能是参与内质网压力调控的重要基因。(4)RESS机制的研究及顺式作用元件鉴定以米曲霉经典的淀粉酶基因amyB为分泌蛋白的模式基因,外源表达分泌脂肪酶尺ML为报告基因,通过对amyB启动子进行系列的截短和缺失突变分析,在amyB启动子上鉴定出一段参与RESS调控的顺式作用元件(-378到-291),并且-307到-300的八核酸序列TCACGGGC是内质网压力下调控amyB下调的核心序列。同时通过与UPR缺失与组成型激活研究结果综合分析,我们认为AmyR的失活和RESS均参与了内质网压力下的amyB的转录抑制调控。