第一部分丹参酮Ⅱ A磺酸钠抗金黄地鼠皮脂腺增生的研究研究背景寻常性痤疮是皮肤科常见的一种累及毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性疾病,其发病机制是多因素综合作用的结果,皮肤脂质过量分泌、毛囊皮脂腺导管角化异常、痤疮丙酸杆菌的大量繁殖及炎症等因素或病理过程被认为是构成痤疮发病的主要环节。皮脂腺是涉及痤疮发病的一个主要器官,皮脂腺功能亢进,皮脂分泌过多是导致痤疮发病的关键环节,故抑制皮脂腺的活性,控制皮脂分泌是有效治疗痤疮的重要途径。丹参酮是从唇形科中药丹参中提取的脂溶性成分的代表物质,近年来较多临床报道亦显示丹参酮口服用于治疗痤疮、脂溢性皮炎等多种与皮肤脂质分泌过多相关的疾病,效果较好且副作用相对较少,并认为其通过抑制脂质分泌而发挥作用,但有关其抗脂质作用及相关机制的基础研究甚少。丹参酮Ⅱ A是丹参酮发挥广泛药理作用的有效成分之一,已成为研究的热点。金黄地鼠侧腹皮脂腺斑是目前公认的研究药物抗皮脂腺增生的理想模型,故本课题组选择此动物模型和丹参酮Ⅱ A的外用制剂来进行相关研究。目的观察外用丹参酮Ⅱ A磺酸钠(Sodium Tanshinone ⅡA Sulfonate, STS)注射液后金黄地鼠侧腹皮脂腺斑的大小、组织结构、皮脂腺细胞的增殖与凋亡变化,旨在探讨丹参酮Ⅱ A的抗皮脂腺增生作用,为临床应用丹参酮ⅡA治疗痤疮提供实验依据。方法1.实验分组和药物干预成年雄性金黄地鼠20只,随机分成用药0、10、20、30d4个时间组,每组5只。采用自身对照法,随机选择一侧皮脂腺斑予STS外涂,对侧则予生理氯化钠溶液外涂,每天3次。2.皮脂腺斑测量将金黄地鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,用游标卡尺测量各时间组皮脂腺斑大小,以最大横径(DT)×最大纵径(DL)表示。3.组织学及免疫组化观察分别切取各时间组生理氯化钠溶液侧和丹参酮Ⅱ A磺酸钠侧的皮脂腺斑,常规制作病理切片标本并进行HE染色。采用免疫组化法检测各时间组两侧皮脂腺斑组织内皮脂腺细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。4.皮脂腺细胞凋亡检测取石蜡切片采用TUNEL细胞凋亡原位检测法,检测各时间组两侧皮脂腺斑组织内皮脂腺细胞的凋亡。结果1.外用丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对金黄地鼠皮脂腺斑大小的影响用药前两侧皮脂腺斑大小比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。随着用药时间的延长,生理氯化钠溶液侧与STS侧皮脂腺斑大小(DT×DL)的差距逐渐增大；至用药30d,STS侧皮脂腺斑明显缩小,与生理氯化钠溶液侧比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2.外用丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对金黄地鼠皮脂腺斑显微结构的影响用药前,两侧表皮下皮脂腺呈分叶状分布,部分开口于毛囊口,结构完整,排列较紧密。用药10d,两侧表皮下皮脂腺分布无明显改变。用药20d,STS侧表皮下皮脂腺较生理氯化钠溶液侧薄,排列较松散,部分腺叶变小且数目较少。用药30d,STS侧皮脂腺变薄,腺体数量较少,体积变小,呈明显萎缩状,排列疏松。3.外用丹参酮ⅡA磺酸钠(STS)对皮脂腺细胞增殖、凋亡的影响与生理氯化钠溶液侧比较,STS侧皮脂腺细胞PCNA表达下调(P<0.01),而凋亡增加,且用药至20d时,凋亡现象更加明显(P<0.01),皮脂腺中央部较周围凋亡多。结论外用丹参酮ⅡA磺酸钠能明显缩小金黄地鼠侧腹皮脂腺斑,改变皮脂腺斑的显微结构,可有效抑制皮脂腺增生,这种抑制作用可能与丹参酮ⅡA磺酸钠直接减少皮脂腺细胞的增殖,并诱导其凋亡增加有关。第二部分丹参酮ⅡA对HaCaT细胞脂质合成通路的影响及机制研究研究背景近年来固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein, SREBP)通路在脂质合成与分泌机制研究中成为关注的焦点。SREBP是动物体内脂质合成的一个重要调节因子,它能与脂质合成酶基因的启动子/增强子的固醇调节元件结合,激活靶基因的转录,特异性调控胆固醇、脂肪酸和甘油三酯的代谢。哺乳动物基因编码的SREBP有三种亚型：SREBP-1a, SREBP-1c和SREBP-2。 SREBP-1a主要调控胆固醇、甘油三酯代谢的低密度脂蛋白受体(LDL受体)的基因转录,SREBP-1c则选择性调控脂肪酸、甘油三酯合成酶基因的表达水平,而SREBP-2则优先参与胆固醇合成酶的基因调控。其中,SREBP-1c构成体内90%的SREBP-1,是脂代谢尤其是脂肪酸代谢中的关键调控点,它通过调节脂肪代谢相关酶的基因表达来调控体内的脂质合成。既往有体内研究证实：雄激素可通过激活皮脂腺组织中SREBP通路,调控脂质合成相关酶的基因转录,从而促进皮肤脂质的合成与分泌。除皮脂腺外,表皮中的角质形成细胞(KC)是皮肤表面脂质的另一重要来源,可通过激活SREBP-1而促进脂质合成。目前,临床上用于治疗痤疮、脂溢性皮炎等疾病的抗皮脂分泌药物中,丹参酮的应用较为广泛,效果较好且副作用相对较少。本课题组在第一部分研究中已观察到外用丹参酮ⅡA可明显抑制金黄地鼠皮脂腺的增生,另有研究指出丹参酮ⅡA可通过抑制皮脂腺细胞增殖及脂质合成或间接下调皮脂腺细胞雄激素受体mRNA的表达而具有抑制脂质分泌的作用。诸上研究均证实了丹参酮ⅡA的抗脂质作用,但其作用途径和机制尚不明确。目的进一步探讨丹参酮ⅡA通过何种途径或机制发挥抗脂质分泌的作用,本实验拟从以下几个方面进行研究：(1)二氢睾酮(DHT)在HaCaT细胞SREBP-1c表达中的作用；(2)PI3K/AKT和MAPK信号途径在DHT诱导HaCaT细胞SREBP-1c及其靶基因表达中的调控作用；(3)丹参酮Ⅱ A对DHT激活的SREBP-1c通路的影响及信号机制。方法1.细胞培养用含10%小牛血清及1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养永生化人皮肤角质形成细胞株HaCaT细胞,待其贴壁长至70%～80%融合时用于实验。2.细胞处理和实验分组首先,采用不同浓度(0、10、100、1000nmol/L) DHT作用于HaCaT细胞观察其SREBP-1c的表达情况。然后,以100nmol/L的DHT作为刺激量,随机分成空白对照组、DHT组、PI3K抑制剂(LY294002)+DHT组、MEK抑制剂(PD98059)+DHT组,按实验设计处理后进行相关检测来研究PI3K/AKT和MAPK信号途径在DHT诱导HaCaT细胞SREBP-1c及脂质合成酶基因表达中的作用。最后为进一步探讨丹参酮ⅡA对DHT诱导的HaCaT细胞SREBP-1c通路的影响,将细胞随机分为5组：空白对照组、DHT组、丹参酮ⅡA1.25μmol/L+DHT组、丹参酮Ⅱ2.5pmol/L+DHT组、丹参酮ⅡA5μmol/L+DHT组,按实验设计处理后进行相关检测。3. SREBP-lc及脂质合成酶基因的检测细胞按实验分组条件处理后,实时荧光定量PCR检测HaCaT细胞SREBP-lc mRNA.脂质合成酶(FAS、ACS、SCD、 HMGCR) mRNA表达。4. SREBP-1c蛋白和相关信号蛋白的检测细胞按实验分组条件处理后,蛋白印迹法(Western Blot)检测HaCaT细胞SREBP-1、p-AKT、p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白的表达。5.脂质合成的检测细胞按实验分组条件处理后,油红染色法观察HaCaT细胞的脂质含量变化,尼罗红染色后应用流式细胞仪检测HaCaT细胞的脂质合成情况。结果1.DHT对HaCaT细胞表达SREBP-1c的影响未经DHT刺激的HaCaT细胞SREBP-lc mRNA和蛋白表达水平较低,分别予10nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L的DHT刺激24h后,HaCaT细胞SREBP-1c mRNA和蛋白的表达明显增强,且呈一定的剂量依赖性,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2.DHT对HaCaT细胞PI3K/AKT.MAPK信号途径的影响10、100、1000nmol/L的DHT均可诱导AKT、ERK磷酸化,p-AKT和p-ERK蛋白的表达较对照组均明显增强(P<0.05),且呈一定的浓度剂量依赖关系,而p-P38及p-JNK蛋白的表达均未见明显改变。3.LY294002和PD98059对DHT诱导HaCaT细胞SREBP-lc表达的影响以100nmol/L DHT作为刺激量,分别加用特异性抑制剂LY294002和PD98059(浓度均为50μM)预处理40min,作用24h后HaCaT细胞p-AKT、p-ERK蛋白的表达均明显下降,与单纯DHT组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。同时,加入LY294002预处理后, HaCaT细胞SREBP-1c mRNA和蛋白的表达水平较单纯DHT组明显降低(P<0.05)；而加入PD98059预处理后,SREBP-1c mRNA和蛋白的表达与单纯DHT组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。4.LY294002和PD98059对DHT诱导HaCaT细胞SREBP-1c靶基因表达的影响FAS、ACS、SCD、HMGCR均是参与脂质合成的关键酶,其基因转录由SREBP-1c调控。100nmol/LDHT作用24h后可诱导HaCaT细胞FAS、ACS、SCD、 HMGCR mRNA的表达水平显著增加,与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。用LY294002预处理40min后DHT诱导SREBP-1c靶基因表达的作用能够被显著抑制(P<0.05),而用PD98059预处理40mmin后无此抑制作用(P>0.05)。5.丹参酮ⅡA对DHT诱导HaCaT细胞SREBP-1c表达的影响100nmol/L DHT作用于HaCaT细胞24h后, SREBP-1c mRNA和蛋白的表达均高于空白对照组(P<0.05),分别加入1.25、2.5、5μmol/L丹参酮ⅡA预处理24h后,与单纯DHT组表达水平比较,HaCaT细胞SREBP-1c mRNA和蛋白的表达均受到不同程度的抑制(P<0.05)。6.丹参酮ⅡA对DHT诱导HaCaT细胞脂质合成酶基因表达的影响100nmol/LDHT作用24h后可诱导HaCaT细胞FAS、ACS、SCD、HMGCR mRNA的表达水平显著增加,与空白对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。将2.5μmol/L丹参酮ⅡA作为刺激浓度,预处理24h后HaCaT细胞FAS、ACS、SCD、HMGCR mRNA的表达水平较单纯DHT组明显下降(P<0.05)。7.丹参酮ⅡA对DHT诱导HaCaT细胞脂质合成的影响丹参酮ⅡA (2.5μmol/L)预处理24h后加入DHT(100nmol/L)刺激24h,油红染色法观察到：与对照组比较,DHT可刺激HaCaT细胞合成橘红色脂质增多,丹参酮Ⅱ A预处理后其合成的脂质明显减少。尼罗红染色后经流式细胞检测显示：DHT组平均荧光强度较对照组明显升高(P<0.05),而丹参酮ⅡA+DHT组的平均荧光强度较DHT组下降(P<0.05)。8.丹参酮ⅡA对DHT诱导HaCaT细胞AKT磷酸化的影响AKT通过磷酸化而被活化,与空白对照组相比,100nmol/L DHT处理24h后HaCaT细胞p-AKT蛋白的表达水平明显增加(P<0.05)。用2.Sμmol/L丹参酮ⅡA预处理24h后,p-AKT蛋白表达下降,与单纯DHT组比较差异具有统计学意义(P<0.05),其作用类似于LY294002。结论二氢睾酮可激活HaCaT细胞中SREBP-1c通路,具体表现为上调SREBP-1c的表达及其靶基因(FAS、ACS、SCD、HMGCR)的转录,最终导致其脂质合成与分泌增多。PI3K/AKT信号途径在DHT诱导HaCaT细胞脂质合成与分泌的过程中发挥重要的调控作用。丹参酮Ⅱ A通过发挥类似于PI3K抑制剂的作用对DHT激活的SREBP-1c通路具有明显的抑制作用。本研究提示丹参酮ⅡA可以抑制雄激素过多所致的脂质分泌,并可用于痤疮、脂溢性皮炎等脂质分泌过多所致的皮肤疾病。