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目的:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术针对肿瘤的突变位点进行基因修饰,增强肿瘤细胞的免疫原性,从而使得免疫细胞疗法针对低抗原性肿瘤细胞具有更好的效果,为增加肿瘤细胞的免疫识别靶点、增强抗肿瘤的特异性、拓展抗肿瘤的细胞免疫治疗奠定基础。方法:一、构建HLA-A2+的K562细胞株,以便于提呈插入的外源表位肽。从T2细胞c DNA中克隆出编码HLAA0201的全长基因序列,连接B2M后作为完整HLAA2型MHC I类分子编码基因连入慢病毒表达载体,以此载体包装慢病毒,利用此慢病毒为不表达MHC I类分子的K562细胞系引入HLAA2型MHC I类分子,使其具有完整的抗原呈递能力,使用BIMAS和SYFPEITHI基于HBV表面蛋白预测对HLAA2亲和的表位,并通过T2负载肽验证抗原表位的亲和情况,最后通过检测肽特异性CTL针对K562-A2细胞负载肽后IFN-γ分泌情况验证引入HLAA2型MHC I类分子的K562细胞是否具有HLAA2限制性抗原的呈递能力。二、对K562细胞TP53基因的突变位点进行修饰,为其引入源于HBV的抗原表位。通过电穿孔的方式进行转染,首先从电压、脉冲时间、质粒用量等方面对K562细胞电穿孔转染的条件进行优化,其次使用优化好的电转条件转染编辑质粒PX458和Donor,通过Junction PCR验证基因的敲入情况,通过有限稀释法获取带有红色荧光标记的阳性细胞。三、质谱鉴定利用CRISPR-Cas9敲入的抗原表位肽是否被正确呈递至细胞表面。我们通过弱酸洗脱的方式洗下细胞表面多肽分子,经SPE C18柱分离纯化后,所得的样品使用UPLC/MS分析组成情况,通过差异比较的方法验证敲入表位的正确提呈。此外,通过分析所敲入片段的胞内酶解肽段的信噪比差异情况,我们可以从侧面验证针对突变位点的基因修饰所引入的抗原表位是否能够呈递并且可以分析不同表位针对特定MHC分子的亲和情况。四、体外共孵育以检测HBV反应性的淋巴细胞是否能够识别经基因修饰的K562所提呈的HBV表位肽。健康人PBMC流式检测H LA分型,取分型为HLAA2单核细胞于体外通过细胞因子刺激诱导成熟DC细胞,通过成熟DC细胞负载表位肽HBs Ag335-343肽与HLA A2型PBMC共刺激培养诱导HBs Ag335-343肽特异性CTL,使用钙黄绿素法验证CTL对负载HBs Ag335-343肽的T2细胞的杀伤,然后用肽特异性CTL在不同效靶比下针对K562、K562-A2、K562-A2-HBs Ag细胞进行杀伤试验,用钙黄绿素法验证杀伤效果,最后用HLAA2抗体阻断试验验证杀伤过程是否具有HLAA2限制性。结果:一、成功克隆了编码HLAA0201型MHCI类分子的基因序列,并以此构建慢病毒表达载体,基于此载体包装慢病毒并感染K562细胞,通过药物筛选和流式分选,我们获取了稳定表达HLAA2型MHC I类分子的K562细胞,通过CCK8法测定该细胞系和原K562细胞系生长曲线,两种细胞系生长状况无明显差异,通过IFN-γElisa实验证明了K562-A2具有呈递HLAA2限制性表位肽的功能,这为后续基因敲入表位的正确提呈奠定基础。二、通过多次电穿孔转染实验优化K562细胞系电穿孔转染质粒的条件使得大分子质粒PX458能够高效率（>60%）转染K562细胞系,成功构建了包含有HBs Ag335-343编码序列和Mcherry标记的Donor,共转染PX458和Donor到K562-A2细胞系,通过有限稀释法我们得到了在K562-A2细胞系TP53基因插入HBs Ag335-343编码序列和Mcherry的K562-A2-HBs Ag细胞系,Junction PCR测序结果验证了插入位点正确。三、洗脱样品经SPE C18柱纯化后通过全波长扫描检测,结果显示样品吸光度在200nm-220nm间差异显著,可以认为成功提取到部分细胞表面多肽,经过UPLC/Q-TOF MS检测,K562-A2-HBs Ag样品组在标准品位置有特异峰出现,对照组K526和K562-A2组在此处无峰出现,表明特异位点敲入抗原能够呈递至细胞表面,肽段的信噪比结果也从侧面验证了此观点。四、由流式表型实验可知,成功分离并诱导了成熟DC细胞,由细胞形态变化可知DC成功诱导了CTL,通过诱导CTL对负载HBs Ag335-343肽的T2细胞的杀伤情况可知,诱导的CTL具有肽特异性,肽特异性CTL杀伤靶细胞试验结果显示相对于K562和K562-A2靶细胞组,K562-A2-HBs Ag靶细胞组在各个效靶比上皆有更高的裂解率,并且通过HLAA2抗体阻断实验证明力肽特异性CTL对靶细胞的杀伤具有HLAA2限制性。结论:针对肿瘤细胞的突变位点利用Crispr-Cas9基因编辑的方法特异性为突变位点引入特定的外源抗原表位基因,将Crispr-Cas9对突变位点的特异性识别转化为免疫系统对肿瘤细胞的特异性识别,从而显著增强机体免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀伤能力是切实可行的,我们认为这是增加肿瘤细胞的免疫识别靶点、增强抗肿瘤的特异性、拓展抗肿瘤免疫治疗应有的一个重要发展方向。