利用噬菌体技术检测细菌是一类现代细菌检验方法,根据具体展开时的技术差异,又分为噬菌体扩增技术、发光噬菌体技术和裂解产物分析。噬菌体扩增技术将每个活宿主菌转变为一个噬菌斑,根据噬菌斑计数结果检出宿主菌的活菌含量;发光噬菌体技术可使宿主菌发光,直接在落射荧光显微镜下计数,或通过宿主菌繁殖噬菌体而增加发光强度,间接定量宿主菌的活菌含量;裂解产物分析通过测定噬菌体裂解宿主菌释放特异物质产生的信号而定量宿主菌的活菌含量。这些方法速度快、灵敏度高、专一性强且费用低廉。其中后两种技术用于检验大肠杆菌的研究已有报道,但用相对更经济的第一种方法检验大肠杆菌的研究尚属空白。本研究以T4和三种E. coli菌株为模型材料,研究运用噬菌体扩增和实时PCR复合技术快速检验细菌的方法。整个研究包括五个部分。1、寻找能在很短时间内将模拟样品中T4宿主型大肠杆菌有效而完全侵染所需的T4浓度。2、建立离心-微滤复合技术,清洗掉样品中游离T4和其他杂质。3、建立受侵染大肠杆菌在膜组件内裂解产生子代T4并洗脱和收集T4形成转换样品的适当方法。4、建立转换样品子代T4含量和模拟样品大肠杆菌活菌含量之间的数量关系。5、建立运用噬菌体计数法、PCR和实时PCR定量测定转换样品子代T4含量的适宜技术。最后,指明本模型研究的主要进展和存在的问题。第一部分研究结果表明:能够在5min内有效而完全侵染液态模拟样品中T4宿主型大肠杆菌所必须采用的T4滴定度为109-108PFU/mL,最好为5×108PFU/mL。因为T4用量减少会发生漏侵染,T4用量过多则会增加下一步试验中清除游离T4的负担。在完成侵染过程后,应该立即进入离心-微滤复合清洗步骤,以避免多重侵染的发生。第二部分研究结果表明:对于单纯以大肠杆菌配制的模拟样品, LB或TS肉汤是离心-微滤复合清洗样品中游离T4和其他杂质的最佳清洗剂。对于真实样品,宜用大肠杆菌选择性液态培养基作为清洗剂,从而限制样品中其他微生物的生长。先经两次离心法清洗与分离,使样品中大部分游离T4随上清液弃去,接着将包含受侵染大肠杆菌在内的沉淀物重新分散于肉汤,转移到孔径为0.2-0.22μm的聚砜或甲基纤维素注射式微滤膜组件中,再用90mL LB肉汤连续以微滤方式清洗与分离,将样品中剩余的游离T4清除,并将已受侵染的大肠杆菌截留在膜组件中。整个清洗操作在30 min内完成,所以清洗中不损失子代T4。第三部分的研究结果表明:截留在膜组件内的受侵染大肠杆菌宜在膜组件内完成产生子代T4的过程。在结束清洗时,使用一次性使用针管和针头帽将膜组件封闭以防样品被环境污染,转入37℃培养箱保温,受侵染的大肠杆菌依靠膜组件内剩余的肉汤提供营养,绝大多数在50min内完成裂解。在保温90min时,使用定量的SM buffer洗脱膜组件中子代T4,收集滤出的洗脱液就得到转换样品。转换样品组成相当简单,它不含有细胞和杂质,介质为SM buffer,残留的游离T4很少且含量稳定,只有子代T4和大肠杆菌裂解产生的可滤出物的数量未知,为定量分析子代T4的理想样品。根据以上研究结果和T4测定方法,本研究确立了液态模拟样品的系统转换方法。当采用噬菌斑计数法测定T4含量时,样品转换法如下:向0.9mL液态模拟样品中加入0.1mL的T4工作液(T4滴定度≥4×109PFU/mL)形成1mL起始样液,轻轻振摇中于37℃保温5min,接着在12000rpm下离心2min,弃去上清液,沉淀重新分散在1mL LB肉汤中,重复相同的‘离心-重新分散’操作两次,将最后一次重新分散液完全转入膜孔为0.2-0.22μm的聚砜或甲基纤维素注射式膜组件中,经过9次微滤式洗滤(每次用10mL LB肉汤并弃去滤液)后,保持针管和膜组件连结,并在膜组件出口戴上一次性使用的针头帽,将封闭的膜组件转入37℃培养箱,保温90min时取出,用10mL SM buffer洗脱子代T4,收集滤液得到转换样品。当采用PCR或实时PCR法测定T4含量时,样品转换法除一点改动外,其他完全与上述样品转换方法相同。这一改动是:用1mL SM buffer代替10 mL SM buffer洗脱并收集子代T4。第四部分的研究结果表明:将Escherichia coli B,Escherichia coli K 12或Escherichia coli AMC 198(代表T4宿主型大肠杆菌菌株)配制的模拟样品用上述方法进行样品转换,模拟样品T4宿主型大肠杆菌活菌数的对数和转换样品子代T4数量的对数呈线性关系,通过试验数据的回归分析,这种关系展示为一元线性回归方程。理论分析说明:决定该方程的斜率和截距的因素包括样品转换中受侵染大肠杆菌的营养供给、使用的清洗剂种类、使用的膜组件、参试的大肠杆菌菌株和样品转换的试验操作方法。Pseudomonas fluorescens或Citrobacter Froundii(代表T4宿主型大肠杆菌以外的其他微生物)存在于样品中时不引起转换样品子代T4含量增加,但它们具有争夺营养而降低受侵染大肠杆菌产生子代T4数量的可能性,应通过样品转换中供给受侵染大肠杆菌充足营养并采用大肠杆菌选择性培养基为清洗剂而加以消除。当样品转换中采用大肠杆菌选择性培养基为清洗剂、固定采用一种膜组件、注意保证供给受侵染大肠杆菌充分的营养和保持操作方法始终如一时,样品中T4宿主型大肠杆菌数量对数和转换样品子代T4数量对数间的一元线性回归方程就只和参试菌株有关。所以,从一类样品中分离出大肠杆菌做为混合参试菌株进行模拟试验得出的方程,可在以后检验同类样品的T4宿主型大肠杆菌活菌含量时应用。第五部分的研究结果表明:噬菌斑计数法是测定转换样品T4含量的可靠方法之一,将它和第一种样品转换方法结合形成的T4宿主型大肠杆菌检验方法简单可行,该方法测定模拟样品时的检测极限约为20CFU/mL,整个检验过程需时8-9h。PCR可作为粗略定量测定转换样品中T4含量的一种方法。源于T4 ligase基因序列的一对引物的专一性和灵敏度较高,这对引物用于PCR时的最适退火温度为58℃。将换样品制成模板样液时使用水煮法的效果相当良好。以系列转换样品制成系列模板样液,在优化的条件下进行PCR和电泳分析,可以区别系列转换样品中T4含量的差异,检测极限为500PFU/mL。实时PCR可以精确测定转换样品T4含量。采用Light Cycler Fast Start DNA Master plus SYBR Green I复合试剂的扩增效率明显高于采用普通实时PCR试剂。当采用这种复合试剂和Lig F和Lig R引物时,适宜的实时PCR条件为:各引物的浓度控制为0.5mM,反应体系总体积为20μL,模板样液用量为5μL,退火温度和时间为61℃和5sec,延伸温度和时间为72℃和10sec,第一个循环的变性温度和时间为95℃和5min,其他循环的变性温度和时间为95℃和8sec。当以浓度10倍递减的T4 DNA水溶液为系列模板样液进行试验时,实时PCR扩增曲线等距排列,系列Ct值等差递增,熔点曲线仅含特异扩增产物峰,其熔点约为82℃;当以水煮系列转换样品制备的系列模板样液进行试验时,实时PCR扩增曲线依次排开,系列Ct依次递增,检测极限约为35PFU/mL。表明实时PCR可作为高灵敏度定量测定转换样品T4含量的一种方法。将它和样品转换法以及水煮法制备模板样液的技术结合,可在3.5h以内完成T4宿主型大肠杆菌的定量检测。总之,本研究开创了一种快速检验T4宿主型大肠杆菌的方法。它通过2h的样品转换过程将T4宿主型大肠杆菌以确定的数量关系转换为子代T4,再通过1h左右的实时PCR分析过程测出转换样品中子代T4的数量,接着就可计算出样品中T4宿主型大肠杆菌的活菌数。这种方法不能测定非T4宿主型大肠杆菌,需要找出能够侵染各种大肠杆菌的噬菌体代替T4解决这一问题。虽然存在这种缺陷,但本方法作为一种具有广泛利用空间的新技术雏型,预计有良好的发展和应用前景。