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去氢甲睾酮(1-Dehydro-17a-methyltestosterone,DMT)是一种人工合成的雄性甾醇类蛋白同化激素,在临床医学和畜牧养殖中有着广泛的应用,但它在人体内的积累会给人体健康造成严重威胁。国内外已出台相关的法律法规明确禁止DMT在畜牧生产中的使用。为有效地监控动物源性食品中的DMT’残留,有必要研究和建立新型快速、灵敏的DMT检测方法。
目前DMT残留检测主要采用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)、液相色谱一质谱联用法(LC-MS/MS)等仪器分析方法。但由于其操作步骤繁琐、耗时长、费用高等原因而不适于基层以及大批量样品的筛查与检测。而免疫学检测方法以其较高的灵敏性、特异性、简便性和批量性等优点被广泛应用于兽药残留的检测。本研究旨在研制快速检测动物源性食品中DMT残留的间接竞争酶联免疫试剂盒,主要研究内容和结果如下:
1.复苏并扩大培养了能稳定分泌DMT抗体的单克隆杂交瘤细胞株1D6F1084,采用小鼠腹水法制备单克隆抗体。用正辛酸-饱和硫酸铵法和饱和硫酸铵沉淀法对其进行纯化,分别用ELISA和SDS-PAGE对纯化后的单克隆抗体进行评价,结果显示正辛酸-饱和硫酸铵法纯化单抗结果较好。测定制得单抗的亲和力达到9.87×107L/mol,属于高亲和力抗体;测定制得的单抗与DMT结构类似物TP、TB的交叉反应率均小于1%,有较好的特异性,达到制备ELISA试剂盒的实验需求。
2.确定了ELISA试剂盒实验所需要的最佳包被浓度为1μg/mL,抗体工作浓度为稀释8000倍;确定了最佳包被条件为以0.05M的CBS作为包被缓冲液(pH9.6)4℃包被过夜,最佳封闭条件为以3%聚乙二醇作为封闭液37℃封闭2h;确定DMT标准品与抗体的体积比选择为50:50,竞争时间为50min;最佳酶标二抗稀释度为1:8000,酶标二抗作用时间为60min;底物缓冲液与TMB储存液的体积比为20:1,显色时间选择为15min;洗液中Tween-20浓度为0.5%。试剂盒标准曲线呈现典型的S型,线性范围在0.1～100ng/mL;从灵敏度、准确度、精密度、特异性和稳定性五个不同方面评估了制备的DMT-ELISA试剂盒:最低检测限范围为0.055±0.012ng/mL,IC50范围为3.059±0.169ng/mL;对猪肉添加试验的回收率在87.41%～110.70%,变异系数为2.05%～10.81%;标准品可重复试验的变异系数为3.16%～4.64%,样品可重复试验的变异系数为6.97%～10.48%;对DMT的结构类似物TP和TB的交叉反应率均＜1%;在4℃下保存6个月后,其整体水平仍能满足试剂盒的检测要求。
3.研究了猪肉、猪肝、饲料、尿液、鸡蛋5种样品的前处理方法,优化了前处理条件。用试剂盒分别测定DMT的低、中、高浓度下的回收率,然后通过与HPLC方法比对来验证ELISA试剂盒方法的有效性:猪肉样品的最佳有机提取剂为10%甲醇,ELISA试剂盒测定的回收率为90.85%～104.84%,CV为3.49%～12.41%,HPLC方法测定的回收率为91.01%～100.82%,CV为1.88%～6.27%;猪肝样品的最佳有机提取剂为正己烷,ELISA试剂盒测定的回收率为97.80%～103.01%,CV为10.08%～14.13%,HPLC方法测定的回收率为92.41%～100.94%,CV为0.36%～4.38%;饲料样品的最佳有机提取剂为80%乙腈,ELISA试剂盒测定的回收率为90.08%～91.68%,CV为1.64%～11.73%,HPLC方法测定的回收率为87.98%～89.34%,CV为0.46%～1.01%;尿液样品的最佳有机提取剂为乙酸乙酯-二氯甲烷(4:1),ELISA试剂盒测定的回收率为87.11%～90.48%,CV为2.73%～7.63%,HPLC方法测定的回收率为87.71%～92.00%,CV为0.23%～0.44%;鸡蛋样品的最佳有机提取剂为甲醇,ELISA试剂盒测定的回收率为89.35%%～05.16%,CV为3.64%～12.60%,HPLC方法测定的回收率为87.14%～96.48%,CV为0.48%～0.83%。