痛风是体内嘌呤代谢紊乱,尿酸钠沉积在关节腔所引发的关节炎疾病。近年来,随着人类生活方式和饮食结构的变化,痛风的发病率逐年升高。痛风的发作常伴有多种并发症,包括肾脏疾病、心血管疾病和代谢综合征等,严重威胁着人类健康。目前安全、有效、经济的治疗痛风的药物较少。因此从资源丰富的中草药中寻找安全高效的药物已经成为开发治疗痛风药物的研究热点。越来越多的中药被用来治疗痛风疾病,但中药治疗痛风的作用机制尚不清楚。本文将从分子水平、细胞水平和动物水平筛选具有治疗痛风作用的中药,并利用代谢组学的研究方法从细胞水平和动物水平研究中药治疗痛风的多途径作用机制。主要内容和结果如下:1.痛风治疗中药的体外和体内活性筛选首先,针对痛风发病的两大关键病理环节—尿酸钠结晶沉积诱发炎症发生和黄嘌呤氧化酶活性异常导致尿酸生成增多,分别建立尿酸钠诱导的人脐静脉血管内皮细胞体外急性痛风模型和基于UPLC-TQ-MS分析方法的黄嘌呤氧化酶抑制活性评价模型。利用这两个模型,在细胞水平和分子水平上对33个中药粗提物进行了体外综合活性筛选。结果表明,银杏叶、丹参、大黄、虎杖、卷柏、芍药具有较好的抗炎作用和黄嘌呤氧化酶抑制作用。在动物水平上,利用黄嘌呤和氧嗪酸钾联合腹腔注射,以及尿酸钠溶液直接注射关节腔的方法,建立急性痛风并高尿酸血症大鼠模型,以大鼠关节肿胀度、血清中IL-1β的表达水平、肾脏和关节的病理学变化,作为基本指标评价药物治疗作用。结果表明,与模型组比较,中药银杏叶、卷柏、虎杖、大黄、丹参和赤芍均能够降低关节肿胀度、降低血清IL-1β水平、改善肾脏和关节滑膜组织病理变化,对急性痛风并高尿酸血症均具有不同程度的治疗作用。2.六味中药对体外急性痛风细胞模型的代谢组学研究利用尿酸钠诱导造成体外急性痛风细胞模型,分别给予银杏叶、丹参、大黄、虎杖、卷柏和赤芍粗提物,考察中药对细胞内源性代谢物的影响。运用UPLC-ESI-QTOF/MS的分析方法,结合正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)方法,对正常组和模型组的代谢差异物进行分析,共鉴定出16个潜在的内源性生物标记物,主要涉及谷胱甘肽代谢、嘧啶代谢、嘌呤代谢和氨基酸代谢。中药银杏叶、丹参、大黄、虎杖、卷柏、赤芍粗提物对尿酸钠引起的潜在生物标记物紊乱有不同程度的回调作用,且银杏叶能够回调的潜在生物标记物较多。3.六味中药治疗急性痛风并高尿酸血症的作用机制研究应用UPLC-ESI-QTOF/MS联用技术,结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)方法对正常组、模型组和各给药组大鼠尿液样本中的内源性生物标记物进行鉴定。与正常组比较,在模型组中共鉴定出27个与急性痛风并高尿酸血症相关的潜在生物标记物,涉及色氨酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、酪氨酸代谢和脂肪酸代谢等。六味中药分别从不同的代谢通路发挥治疗急性痛风并高尿酸血症的作用。(a)在银杏叶组和模型组的对比分析中,共找到18个潜在生物标记物,主要影响的代谢通路为色氨酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、赖氨酸降解和脂肪酸代谢等;(b)在卷柏组和模型组的对比分析中,共鉴定出18个潜在生物标记物,涉及色氨酸代谢、赖氨酸降解、酪氨酸代谢、嘧啶代谢和嘌呤代谢等;(c)在虎杖组和模型组的对比分析中,共找到21个潜在生物标记物,主要影响的代谢通路为色氨酸代谢、TCA循环、苯丙氨酸代谢、赖氨酸降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢等;大黄组和模型组的对比分析中,共找到18个潜在生物标记物,主要影响的代谢通路为色氨酸代谢、TCA循环、苯丙氨酸代谢、赖氨酸降解等;虎杖和大黄均是富含蒽醌类化合物的中药,都能够回调的潜在生物标记物为10个;(d)丹参组和模型组的对比分析中,鉴定出16个潜在生物标记物,涉及的代谢通路包括色氨酸代谢、TCA循环、酪氨酸代谢、嘌呤代谢、嘧啶代谢、苯丙氨酸代谢;(e)赤芍组和模型组的对比分析中,鉴定出14个潜在生物标记物,涉及的代谢通路包括色氨酸代谢、TCA循环、苯丙氨酸代谢、脂肪酸代谢和赖氨酸降解。4.急性痛风并高尿酸血症大鼠尿液中主要标记物的定量分析:采用UPLC-TQ/MS联用法结合多反应监测(MRM)的方法,定量分析正常组、模型组和各给药组大鼠尿液中10个主要潜在生物标记物,包括胞嘧啶、吲哚-3-羧酸、酪氨酸、3-羟基邻氨基苯甲酸、乳清酸、尿囊素、尿酸、辛二酸、癸二酸和柠檬酸。考察了日间精密度、日间准确度、日内精密度、日内准确度、基质效应和样品回收率,结果表明,所建方法灵敏度高、重现性好、准确度高。定量的标记物含量变化趋势与上述相应生物标记物的含量变化趋势相符合,且证明上述筛选出的潜在生物标记物准确可靠。本研究结果为开发新的治疗痛风的中药提供研究方向,潜在生物标记物的发现为临床诊断痛风性关节炎的发生和发展奠定了理论基础。