研究背景弥漫性大B细胞性淋巴瘤(diffuse large B- cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)中最常见的一种,约占成人NHL的30%～40%,为一组形态学、免疫表型、遗传学和临床表现都具有明显异质性的B细胞性淋巴瘤。在欧美国家,DLBCL的发病率约占NHL的31%,在亚洲国家占NHL大于40%。近年来我国淋巴瘤的发病率呈逐渐上升趋势,我国每年初发患者约4.5万人,死亡人数超过2万人。DLBCL可发生于任何年龄,但以老年人多见,中位发病年龄为60～64岁,男性稍多于女性。该病侵袭性较高,联合化疗只能使约40%的患者达到持续缓解,故仍有许多DLBCL患者疗效不佳。有关预后指标临床上目前使用较为普遍的是国际预后指数(InternationalPrognostic Index,IPI),但因不能体现免疫表型的差异性,故对大部分患者的预后仍不能准确评估。若能找到更有效的临床应用中更加方便可行的评价预后或复发的指标,从而对患者进行更为积极恰当的治疗,将有助于改善疗效和预后。DLBCL不同的基因表达谱为人们研究其预后指标提供了新的平台,2000年Alizadeh等首次利用基因芯片技术将其分为两型:即生发中心型(germinal enter Bcell like,GCB)和活化型(activated B cell like,ABC)。随后Rosenwald等通过对240例患者的分析又提出第三型(type3)。但是基因芯片技术不可能成为临床诊断中常规方法,寻找更加方便可行的指标具有重要意义。迄今为止,国内外学者已分别进行了CD2O、CD79a、CD10、CD30、Mum-1/IRF-4、Bcl-2、Bcl-6、CD138等数十种免疫标记物的检测,并提出不同的分型标准。2004年Hans等运用基因芯片作为参照,利用免疫组化对152例患者进行CD10、Mum-1、Bcl-6三种抗体的检测,将DLBCL分成GCB与non-GCB两类分子亚型,其中GCB型以CD10和Bcl-6表达阳性为特征,non-GCB型以Mum-1的阳性表达为特征,且认为两型预后有显著差异,前者5年生存率76%,而后者仅34%。但也有人认为两型无明显差别。目前国内外很多研究对某些抗原表达与预后的关系尚存在争议,如Mum-1表达与预后,Zinzani PL认为Mum-1是生发中心相关蛋白,阳性表达提示预后良好;但Hans、Chang等的研究则认为Mum-1是活化型B细胞标记,阳性表达提示预后较差。目前国外常用的数种抗原指标是否足够用于判断DLBCL预后,且是否适用于中国人,国内尚缺乏大样本研究。我们在临床中发现,部分淋巴瘤患者早期即发生骨髓侵犯,而有些患者,即使多处原发病灶且病程晚期,但发生骨髓侵犯的机率却很小,这是偶然现象或是普遍现象,骨髓侵犯的发生是否具有规律性,是否提示某些特殊抗原的表达与骨髓侵犯的发生密切相关?CD44是B细胞正常发育中非生发中心时期的重要抗原标记,与Bcl-6的表达呈负调控,与Stat-3的表达呈正调控。人类CD44基因定位于11号染色体短臂上,作为一种细胞表面跨膜糖蛋白和粘附分子,透明质酸的主要受体,在肿瘤转移和浸润中起重要作用。CD44基因由20个高度保守的外显子组成,拼接组合的方式相当复杂。有报道显示,激活的B细胞和淋巴瘤主要表达一种造血型剪接变异体,简称CD44H,该蛋白基本不含可变外显子;CD44v6是CD44分子中包含外显子6的拼接异构体。在免疫系统中,CD44被称为“归巢受体”,循环的外周血淋巴细胞利用CD44粘附到淋巴结的后毛细静脉上,从而达到淋巴细胞穿过血管壁回到淋巴组织的目的。有证据充分表明,CD44分子在肿瘤细胞表面过度表达,就可增加肿瘤细胞的侵袭浸润和转移能力。Sy MS等将编码CD44的cDNA转染人B淋巴瘤细胞,增加了局部肿瘤的形成和播散倾向。Bcl-6是一种常见的原癌基因,它参与调节淋巴细胞分化、免疫反应、细胞周期发育调控等重要的功能,在B细胞的成熟发育及生发中心的形成起重要的作用。大量研究结果表明,GCB-DLBCL通常高水平表达Bcl-6,其CHOP或R-CHOP方案化疗疗效较好;而ABC-DLBCL细胞中Bcl-6水平很低,而通常可检测到高水平激活的NF—kappa B和Stat-3,对上述化疗反应较差。Stat-3是Bcl-6的直接靶基因,Bcl-6可以直接抑制Stat-3的转录,因此Stat-3只在Bcl-6低表达的ABC-亚型中能够表达并激活。在多种人类肿瘤中目前已明确查明,异常激活的Stat-3能够直接促成肿瘤的发生。研究Bcl-6和Stat-3的相关性和预后差异,对临床有着重要的指导意义。随着抗CD20单抗的出现,目前淋巴瘤进入了免疫化疗的阶段。2007年ASCO发表的另一项历史对照研究表明,无论GCB型或Non-GCB型,R-CHOP比CHOP均能提高OS。Farinha、Nyman等认为GCB型和Non-GCB型患者对免疫化疗具有不同的反应,特别是对于预后差的Non-GCB型,联合利妥昔单抗可增加Non-GCB型患者长期生存,免疫化疗可能消除了GCB/Non-GCB分型对预后的预测价值。本研究将结合抗原表达和Hans分组情况,观察是否联合利妥昔单抗对疗效的影响。目的本研究以我院弥漫大B细胞淋巴瘤活检标本为基础,进行相关免疫组化检测(CD20、CD44H、CD44v6、Bcl-6、Stat-3、Mum-1)及临床资料分析,观察所有抗原表达与预后和疗效的关系;根据Hans分型标准和Bcl-6与Stat-3表达情况分组,观察两种分型标准的有效性;了解DLBCL时发生骨髓侵犯的相关抗原因素;分析抗原表达与利妥昔单抗的疗效关系,期望通过以上研究,寻求适合中国人的有效的预后、疗效和预示骨髓侵犯的指标,为指导临床治疗及判断预后提供理论依据。材料与方法1.收集1998年1月～2008年10月间我院诊断且住院完成正规治疗,并资料、随访较全的DLBCL病例120例,建立随访数据,分析临床特征和疗效,随访生存时间和生存状态。2.重新阅读HE片,切取石蜡切片,行CD20、CD44H、CD446、Bcl-6、Stat3及Mum-1抗原免疫组化单染。3.阅读单染切片后,选取CD44H、Stat-3的表达范围均在(+～++)的淋巴结组织蜡块10个,重新切片进行免疫组化双染。4.采用SPSS13.0统计软件进行生存曲线、Cox、卡方检验、Binary logistic回归、等统计方法分析数据。结果1.病例资料:120例弥漫性大B细胞淋巴瘤患者中,男性67例(55.8%),女性53例(44.2%),患者年龄29～82岁,平均年龄54.59岁(中位年龄55岁)。72例原发于淋巴结内(60%),以颈部淋巴结多见,其次是腋窝、颌下和腹股沟淋巴结;48例原发于淋巴结外(40%),以胃肠道多见,其次是扁桃体、睾丸、肝脾、纵膈和其它部位。化、放疗仍是主要的治疗方式,约占90%。2.免疫组化结果2.1 120例DLBCL患者淋巴结组织相关抗原的免疫组化单染结果显示(Fromowitz法计数),114例表达CD20(95.0%),78例表达CD44H(65.O%)、67例表达CD44v6表达(55.8%)、65例表达Bcl-6(54.2%)、50例表达Stat3(41.7%),56例表达Mum-1(46.7%)。2.2 10例患者淋巴结组织CD44H/Stat-3免疫组化双染结果显示,(Fromowitz法计数,)计数CD44H/Stat-3同时在一个细胞表达的细胞数,结果显示(+)组6例,(++)组4例,比较(+)和(++)组间平均有效率和中位生存时间,两组平均有效率依次为66.7%、50%,两组中位生存时间依次为13月、20月。计数CD44H和Stat-3分别在不同细胞上表达的细胞数,其中2例切片的CD44H和Stat-3独立表达分别为CD44H(+)/Stat-3(++)和CD44H(+)/Stat-3(+),比较此2例与其它8例患者的生存时间,中位生存时间分别为12.5月、20月。3.生存情况:120例患者随访时间为6～148个月,中位生存时间17个月,平??均生存时间为27.275个月。4.影响DLBCL患者生存时间的单因素及多因素分析:将各抗原的表达水平和分组、临床指标对生存时间的影响进行单因素分析(Kaplan-Meier分析和Log-rank检验),结果显示13个因素(Hans分组、Bcl-6和Stat-3的表达情况分组、化疗±美罗华、年龄、全身症状、LDH水平、骨髓是否侵犯、IPI评分、结外侵犯数目、病理分期、Bcl-6、CD44H及CD44v6)均对DLBCL患者的生存有显著影响,P值均＜0.05,有显著统计学意义。Cox模型多因素分析对预后的影响,结果显示仅4个因素(化疗±美罗华、年龄、结外侵犯数目、CD44v6)对DLBCL患者的生存有显著统计学意义,P值分别为0.000、0.001、0.000和0.009。5.抗原表达与临床指标的相关性(χ~2检验):5.1将CD20、CD44H、CD44v6、Bcl-6、Stat-3和Mum-1的表达水平与患者年龄、性别、病理分期、结外侵犯数目、骨髓是否侵犯、全身症状和疗效做相关分析,结果显示CD44H表达水平与骨髓侵犯的发生显著正相关(列联系数C=0.205,P=0.022),与疗效呈显著负相关(列联系数C=0.261,P=0.003);CD44v6的表达水平仅与疗效呈显著负相关(列联系数C=0.341,P=0.000),而与骨髓侵犯发生的关联性无显著统计学意义(列联系数C=0.175,P=0.052);Bcl-6表达水平分别与年龄因素和结外侵犯呈显著负相关(列联系数C=0.201、0.247,P=0.025、0.005);Stat-3表达水平与病理分期显著负相关(列联系数C=0.195,P=0.030);Mum-1表达水平与年龄、结外侵犯的发生显著正相关(列联系数C=0.220、0.203,P=0.014、0.023),与骨髓侵犯呈负相关(列联系数C=0.197,P=0.028)。其余均无显著性相关,相关系数的绝对值均小于0.2,P＞0.05。5.2将CD20、CD44H、CD44v6、Bcl-6、Stat-3和Mum-1各抗原表达之间做相关分析,结果显示CD44H与CD44v6的表达存在显著正向关联性(列联系数C=0.345,P=0.000)。Bcl-6与CD44H和CD44v6的表达无显著关系,而与Stat-3和Mum-1的表达存在显著负向关联性(列联系数C=0.220、0.647,P=0.013、0.000)。Stat-3与CD44v6的表达存在显著正向关联性(列联系数C=0.180,P=0.045),而与Mum-1的表达存在显著正向关联性(列联系数C=0.237,P=0.007)。其余抗原间均无显著性关联性,列联系数的绝对值均小于0.2,P＞0.05。6.抗原表达和临床指标多因素的疗效分析(Binary logistic回归):将各抗原的表达水平和临床指标对疗效的影响进行单因素分析,对疗效具显著影响依次为铁蛋白(Ferr)、IPI评分、结外侵犯数目、病理分期、CD44v6、化疗±美罗华、骨髓是否侵犯、乳酸脱氢酶(LDH)水平、全身症状、年龄、CD44H。多因素分析结果显示,仅有结外侵犯数目和CD44v6对DLBCL患者的疗效有显著统计学意义,(P=0.001和0.022)。7.根据抗原表达和治疗方案(±利妥昔单抗)分组的有效率分析(x~2检验)根据各抗原的表达水平和治疗方案(±利妥昔单抗)分组,分析各组有效率,结果均显示美罗华方案能明显提高疗效。CD44v6(+)组、Bcl-6(-)组、Stat-3(+)组的患者中,接受美罗华治疗组较非美罗华组的疗效明显提高,P值分别为0.000,0.003和0.003。GCB和Non-GCB组中,应用美罗华后,有效率明显高于未用美罗华组。结论1.弥漫性大B细胞性淋巴瘤中,本研究分组方法与Hans分型的预后分析趋势一致,即生发中心相关的类型较非生发中心类型的预后较好,用本研究中的分类方法更能帮助判断预后。2.Bcl-6、Mum-1和Stat-3均可作为DLBCL分型的有效指标。3.CD44H的表达与骨髓侵犯密切相关。CD44H和CD44v6与DLBCL的生存期和疗效密切相关。4.利妥昔单抗可明显提高疗效,临床初诊的DLBCL患者,若Bcl-6阴性表达、CD44v6和Stat-3阳性表达,积极利妥昔单抗联合化疗具有重要意义。5.各临床因素中,是否接受美罗华治疗、年龄、骨髓是否侵犯、IPI、结外侵犯数目、病理分期、LDH水平均是影响生存时间的有意义指标。而铁蛋白、IPI、结外侵犯数目、病理分期、是否接受美罗华治疗、全身症状、LDH、年龄均是影响疗效的主要因素。